[发明专利]一种基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法

权利要求书

1.一种基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)合成金纳米簇；

(2)将核酸适配体通过氢键和静电相互作用与金纳米簇结合，得到核酸适配体与金纳米簇的复合物；

(3)将核酸适配体与金纳米簇的复合物置于H₂O₂/TMB显色体系中；

(4)将待测样品、核酸适配体与金纳米簇依次混合孵育并加入H₂O₂/TMB显色体系，通过测定加入待测样品溶液的H₂O₂/TMB显色体系与未加入待测样品溶液的H₂O₂/TMB显色体系之间的吸光度差值，建立标准曲线,定量测定样品溶液中的副溶血性弧菌含量。

2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：将一个20mL样品瓶放置于磁力搅拌器上，设置磁力搅拌器的转速为300～400rpm/min；取0.5mL超纯水新鲜制备的HAuCl₄溶液和4.7mL浓度为60％的乙醇加入到样品瓶中，充分混匀后，加入4mL谷胱甘肽溶液和0.6mLNaOH溶液，再次混合均匀，最后加入0.2mL NaBH₄溶液作为还原剂，并搅拌6～7h；搅拌结束后，将样品瓶中的全部溶液注入透析袋中，并置于蒸馏水中透析24～28d后倒出，得到以谷胱甘肽为配体的金纳米簇，最后1～4℃保存备用。

3.根据权利要求2所述的基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法，其特征在于，所述HAuCl₄溶液的浓度为20mM；所述谷胱甘肽溶液的浓度为5mM；所述NaOH溶液的浓度为0.2M；所述透析袋的截留分子量为3000Da。

4.根据权利要求1所述的基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：将新鲜配制的核酸适配体溶液与步骤(1)合成的金纳米簇充分混匀，之后以25～45℃的温度孵育10～60min，形成核酸适配体与金纳米簇的复合物，最后1～4℃冷藏备用。

5.根据权利要求1所述的基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，核酸适配体的浓度为0.5～15μM，核酸适配体溶液与金纳米簇充分混匀之后以35℃的温度孵育30min；所述步骤(3)中，H₂O₂/TMB显色体系中，H₂O₂的浓度为50～300mM，TMB的浓度为5～30mM，体系的pH为3.8～5.0,反应温度25～45℃，反应时间10～60min。

6.根据权利要求1所述的基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，核酸适配体的浓度为5μM，金纳米簇的浓度为4.8μM，待测样品、核酸适配体与金纳米簇依次混合后以35℃的温度孵育30min；H₂O₂/TMB显色体系中，H₂O₂的浓度为100mM，TMB的浓度为20mM，体系的pH为4.2，反应温度35℃，反应时间2min。

7.根据权利要求1所述的基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，通过酶标仪记录待测样品溶液在652nm处的吸光度，对比未加入待测样品溶液的H₂O₂/TMB显色体系在652nm处的吸光度值，计算△A_652nm，绘制标准曲线，定量测定样品溶液中的副溶血性弧菌含量。