[发明专利]基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法

说明书

本发明公开了一种基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，包括：取核酸适配体功能化的纳米富集磁珠作为捕获探针，捕获反应体系中存在靶细菌，进行孵育后通过磁分离器回收磁珠适配体‑靶细菌；然后向其中加入核酸适配体功能化的量子点；在磁场作用下富集磁珠，将沉淀重悬于缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧光强度，根据荧光强度确定食源性肠道致病菌O157：H7的菌落总数。本发明将功能化量子点应用于食品中E.coli O157:H7检测，结合核酸适配体功能化磁珠富集方法，最终建立E.coli O157:H7高效快速检测方法。

技术领域

本发明涉及一种基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157： H7的方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，也称之为大肠杆菌，是人和动物肠道中最主要、 数量最多的细菌，属于革兰氏阴性菌。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛 抗原(H)和表面抗原(K)，后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大 肠杆菌分为150多型，绝大多数的大肠杆菌是不具有致病性的，而少部分的大肠杆菌却能够 引起胃肠道、泌尿系统或中枢神经系统的疾病，称为致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)。其中最具代表性的就是代号为O157:H7的大肠杆菌，它是EHEC(肠 出血性大肠杆菌)家族中的一员。O157:H7感染后的主要症状正是出血性腹泻，严重者可伴发 溶血尿毒综合征，危及生命。由于O157:H7危害较大，且可经食物和饮用水在人群中广泛传 播，O157:H7被列为常规检测项目。

现在用于大肠埃希氏菌检测的常规方法包括选择性培养方法、以分子生物学为基础的检 测方法、免疫学检测方法和近年来兴起的生物传感器检测技术等。虽然这些方法是当前最基 础和常见的检测方法，但是各自存在不足之处，比如操作过程复杂、耗费时间较长、灵敏度和特异性不高、重复性较差等，因此建立高效快速检测方法是有效预防大肠杆菌病、保障公 共卫生安全的必要基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种基于核酸适配体、纳米粒 子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，将功能化量子点应用于食品中 E.coli O157:H7检测，结合核酸适配体功能化磁珠富集方法，优化食品中E.coliO157:H7检测 条件，最终建立E.coli O157:H7高效快速检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食 源性肠道致病菌O157：H7的方法，包括：

以E.coli O157:H7为靶标，经过多轮筛选富集，获得特异性结合E.coli O157:H7的核酸 适配体；

对所构建的A5适配体进行生物素修饰，通过链酶亲和素和生物素之间的结合反应，获 得核酸适配体功能化的纳米富集磁珠；

对所构建的A4适配体进行量子点修饰，通过共价修饰制备得到核酸适配体功能化的量 子点；

取核酸适配体功能化的纳米富集磁珠作为捕获探针，捕获反应体系中存在靶细菌，进行 孵育后通过磁分离器回收磁珠适配体-靶细菌；然后向其中加入核酸适配体功能化的量子点， 进行孵育结合；在磁场作用下富集磁珠，将沉淀重悬于缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧光强度，根据荧光强度确定食源性肠道致病菌O157：H7的菌落总数。

进一步地，所述A5适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述A4适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述核酸适配体功能化的纳米富集磁珠的制备方法为：

采用共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子；