[发明专利]分离纯化带有至少两个组氨酸标签的蛋白质的方法

说明书

本发明涉及分离纯化带有至少两个组氨酸标签的蛋白质的方法，特别是涉及在溶液中通过使用阳离子来分离纯化带有至少两个组氨酸标签的蛋白质的方法。

技术领域

本发明涉及分离纯化带有至少两个组氨酸标签的蛋白质的方法，特别是涉及在溶液中通过使用阳离子来分离纯化带有至少两个组氨酸标签的蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质的分离纯化是生物技术领域重要的基本操作。现有技术中已经有多种蛋白质分离纯化技术，整体可以大致分为例如层析法和沉淀法两大类。

常用的层析法包括固定化金属离子亲和层析法(IMAC)、免疫亲和层析法(IAC)、离子交换层析法(IEC)、疏水相互作用层析(HIC)、凝胶过滤层析法(GFC)等。其中，金属离子亲和层析法(IMAC)是一种在实验室和工业中重要的蛋白质分离纯化技术，其原理是利用金属离子和不同蛋白质在不同pH下结合强度的不同，实现蛋白质的分离。组氨酸标签和咪唑的使用使得IMAC变得成熟，在实验室中能够较为简单快速地得到纯度较高(90％)的目标蛋白。但是，IMAC的缺陷是固定相载体昂贵，所使用的过渡金属离子对环境和目标蛋白有较大污染。因此，IMAC通常用于实验室规模的蛋白质纯化或者用于高附加值蛋白质(例如免疫球蛋白)的纯化。

常用的沉淀法是蛋白质盐析沉淀，例如硫铵盐析沉淀。盐析沉淀是通过向蛋白质溶液中加入大量中性盐(例如硫酸铵，盐析体系中硫铵浓度高达约2mol/L或更高)，使蛋白质发生沉淀。这种方法的特点是成本低廉，沉淀状态的蛋白质稳定性更好，利于储存和运输，但得到的蛋白质纯度不理想，且沉淀中夹杂大量盐，可能影响后续使用。含高浓度氨氮的废水对环境也有不利影响。

迄今为止，硫铵沉淀和IMAC仍是两种主要的蛋白纯化方法，但各自存在不足。本领域研究者们一直在尝试寻找能够结合二者优势的更为理想的纯化方式。

发明内容

本申请的发明人经过大量研究发现，带有至少两个组氨酸标签的蛋白质(本文中也称为目标蛋白)在与非常低浓度的阳离子在含水溶解中接触时，能够发生选择性沉淀，沉淀物主要包含所述目标蛋白，而杂蛋白大部分保留在上清液中。

此外，本申请的发明人还出人意料地发现，被选择性沉淀的目标蛋白在与特定浓度的阳离子在含水溶液中接触时，能够重新恢复溶解状态，而被沉淀下来的杂蛋白溶解相对较少。

同时，本申请的发明人还出人意料地发现，当将包含目标蛋白与杂蛋白的混合物与一定浓度的阳离子在含水溶液中接触时，相对于目标蛋白，杂蛋白能够被选择性地沉淀出来。

也就是说，通过选择合适的阳离子及其浓度，能够使得目标蛋白发生选择性沉淀和选择性溶解，从而达到目标蛋白的分离与纯化。

本发明方法的优点是不需要昂贵的载体以及复杂的操作条件，使用非常低浓度的阳离子，对环境友好，操作简单，成本非常低，蛋白纯化效果非常好(与IMAC的纯化效果相当或更好，但是成本远低于IMAC)。

附图说明

图1a示出了带有组氨酸标签和没有组氨酸标签的红色荧光蛋白在不同Na⁺浓度下在NaCl体系中的溶解性。

图1b示出了带有组氨酸标签和没有组氨酸标签的红色荧光蛋白在不同Na⁺浓度下在Na₂SO₄体系中的溶解性。

图1c示出了带有组氨酸标签和没有组氨酸标签的红色荧光蛋白在不同Li⁺浓度下在体系中的溶解性。

图1d示出了带有组氨酸标签和没有组氨酸标签的红色荧光蛋白在不同K⁺浓度下在体系中的溶解性。

图1e示出了带有组氨酸标签和没有组氨酸标签的红色荧光蛋白在不同NH⁴⁺浓度下在NH₄Cl体系中的溶解性。