[发明专利]一种羔羊第四胃糖蛋白的提取分离纯化方法及其用途

权利要求书

1.一种羔羊第四胃糖蛋白的提取分离纯化方法，其特征在于按下列步骤进行：

羔羊第四胃糖蛋白的提取：

a、取新鲜羔羊第四胃，用自来水清洗胃腔内容物，剥除脂肪及结缔组织，于温度-80℃下冷冻3h，剪碎，液氮粉碎，冷冻干燥，即得羔羊第四胃粉末；

b、将步骤a所得羔羊第四胃粉末磁力搅拌，石油醚脱脂2次，得羔羊第四胃脱脂粉末，于温度-20℃下冷冻保存；

c、将步骤b所得羔羊第四胃脱脂粉末加入无水乙醇磁力搅拌，除醇溶性小分子杂质，重复2次，减压过滤，自然风干，得脱脂脱色后的羔羊第四胃粉末；

d、以1:30-1:50 g/mL料液比，将步骤c所得粉末用0.5%-3%氯化钠溶液，于温度60℃，超声功率450瓦下，超声30分钟，得到提取液；

e、将步骤d所得提取液在10000转/分下，离心20分钟，上清液于温度50℃下减压浓缩至1/3-1/5体积，得到浓缩液；

f、步骤e所得浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇至终浓度80%，于温度4℃静置24 h，10000转/分下，离心10分钟，取沉淀物；

g、将步骤f所得沉淀物用氯化钠溶液溶解得样品溶液，再以体积比3:1的将样品溶液与氯仿和正丁醇的混合液搅拌充分混合，萃取30min后在3000 rpm离心5 min，收集上层水相部分，重复处理3次，透析脱盐冷冻干燥得到粗糖蛋白，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1；

羔羊第四胃糖蛋白的纯化：

h、将步骤g所得粗糖蛋白用氯化钠溶液配置成浓度10 mg/ml的样品溶液，以氯化钠溶液为洗脱剂，于Sephadex G-50凝胶色谱柱分离，洗脱液通过苯酚-硫酸法在490nm处检测糖的特征吸收，与280nm处检测蛋白质的吸收，选择糖和蛋白的吸收相互重叠的洗脱峰为糖蛋白，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻，浓缩，即得糖蛋白；

i、将步骤g所得糖蛋白，吸附到0.05 M的pH 5.6磷酸缓冲溶液冲洗平衡的DEAE-52离子交换柱，依次用0.05 M的pH 5.6磷酸缓冲液和0.2 mol/L NaC1溶液梯度洗脱，洗脱液通过苯酚-硫酸法在490nm处检测糖的特征吸收，与280nm处检测蛋白质的吸收，选择糖和蛋白的吸收相互重叠的洗脱峰为糖蛋白，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥，即得糖蛋白；

羔羊第四胃糖蛋白高效液相色谱仪分离纯化：

j、将步骤i所得糖蛋白用氯化钠溶解配置成10mg/mL的溶液，用0.45μm滤头过滤，用TSKgel 高效液相凝胶色谱柱分离纯化，色谱条件为，Shimadzu高效液相色谱仪，色谱柱：TSKgel G300PWxL 7.8×30mm，7μm，流动相：1%氯化钠溶液，进样量：30µL，洗脱液流速：0.4ml/min，获得较高纯度的糖蛋白，再将糖蛋白浓缩后在相同色谱条件下再次分离纯化得到高纯度的羔羊第四胃糖蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法获得的羔羊第四胃糖蛋白在制备促进青春双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和粪肠球菌的肠道益生菌生长的保健品中的用途。

3.根据权利要求1所述的方法获得的羔羊第四胃糖蛋白在制备促进青春双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和粪肠球菌的肠道益生菌生长的食品中的用途。