[发明专利]双链特异性核酸酶变体及其应用

说明书

本发明涉及双链特异性核酸酶，特别涉及双链特异性核酸酶变体及其应用。所述双链特异性核酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有一个或多个氨基酸取代；所述氨基酸取代的位点选自第32位、第56位、第91位、第146位、第162位、第247位、第326位或其组合。本发明的双链特异性核酸酶变体与北极虾野生型DSN相比，活性更高；本发明的可溶表达的双链特异性核酸酶变体则解决了野生型DSN在原核表达系统中难以可溶表达的问题，进一步提高了DSN的可溶表达水平和活性；极大的推动了低成本、高效获取高活性DSN的工业化进程。

技术领域

本发明涉及双链特异性核酸酶，特别涉及双链特异性核酸酶变体及其应用。

背景技术

双链特异性核酸酶(Duplex-specific nuclease,DSN)是从虾、蟹等十足目动物的消化腺或肝胰腺中分离得到的一种DNA核酸酶，它能高选择性地识别并切割完全匹配的DNA双链或者DNA-RNA杂交双链中的DNA，而对单链DNA、RNA或者双链RNA没有作用，且能够很好地区分单碱基错配。基于DSN优异的选择性酶切能力，其在生物和医学等领域展现出巨大的应用前景。

商品化的DSN主要源自两大物种：勘察加拟石蟹(Paralithodes camtschaticus)和北极虾(Pandalus borealis)。部分DSN是直接从大量的勘察加拟石蟹和北极虾中提取获得，不利于大规模工业化生产；而异源表达获取DSN虽然降低了成本，但两个物种来源的DSN在原核物种(例如大肠杆菌)均无法以可溶形式表达，需要通过变复性方法获取可溶蛋白，但变复性方法操作繁琐，会损失大量蛋白。除此之外，在DSN使用过程中，还存在活性偏低的问题。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，发明人通过理性设计北极虾双链特异性核酸酶的突变位点，获得高活性的DSN，通过增加可溶标签，改善了DSN难以在原核物种中可溶表达的问题。

为此，本发明目的之一在于提供双链特异性核酸酶变体。

本发明的另一目的在于提供可溶表达的双链特异性核酸酶变体。

本发明的另一目的在于提供上述双链特异性核酸酶变体和上述可溶表达的双链特异性核酸酶变体的应用。

本发明的技术方案如下文所示。

本发明第一方面提供了双链特异性核酸酶变体，所述双链特异性核酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有一个或多个氨基酸取代。

根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸取代的位点选自第32位、第56位、第91位、第146位、第162位、第247位、第326位或其组合。

本发明人在研究中发现，北极虾的野生型双链特异性核酸酶活性较弱，因此，基于“提高DSN的DNA结合能力”、“提高DSN的催化效率”和“提高DSN消化DNA的续进性”三个方面，对野生型DSN进行了优化，通过大量科学研究和创造性劳动，发现野生型DSN第32、56、91、146、162、247或326位置处的单独或组合突变，都能增加DSN的活性；优选地，当氨基酸取代位点为第247位和第326位时，DSN活性得到最大程度提升。

根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸取代选自：G32A、G32N、G32K、A56N、A56K、S91T、S91K、G146N、G146A、G146S、K162R、Y247F、Y247R、T326Q、T326K或其组合。

根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸取代选自：G32N、A56N、S91K、G146N、K162R、Y247R、T326K或其组合。

根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸取代选自：

(1)G32N；

(2)A56N；