[发明专利]一种耐盐的RPK突变体及其应用

说明书

本发明提供了一种耐盐的RPK突变体及其应用。本发明人发现蛋白酶K的一些位点与其耐盐性及稳定性密切相关，在此基础上开发了一种蛋白酶K突变体，与野生型相比，所述突变体的耐盐性及稳定性更好。本发明也提供了优化的表达重组蛋白酶K突变体的方法，其产量高、生产成本低、适合规模化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种耐盐的RPK突变体及其应用。

背景技术

蛋白酶K(PK)是一种非特异性蛋白内切酶，该酶属丝氨酸类蛋白酶，可以切割脂肪族氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸羧基端连接的酯键和肽键。分子量大小为29.3kDa(单体)，在pH4到pH12的条件下均有活性，在SDS、尿素或EDTA存在时亦很稳定。

蛋白酶K能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的降解。此酶经脱色和色谱纯化去除了RNA和DNA，也检测不到其它杂酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，其水解的最小多肽是四肽分子。

然而，本发明人在发酵生产中发现，重组蛋白酶K(RPK)易发生聚集沉淀的问题，给实际生产过程带来问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐盐的RPK突变体及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种蛋白酶K突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于SEQID NO:1所示的蛋白酶K，以下位点发生突变的酶：第266位、第279位；所述位点突变为亲水性或中性氨基酸。

在一个或多个实施方式中，所述的蛋白酶K突变体的第266位突变为Tyr、第279位突变为Gly。

在一个或多个实施方式中，所述的蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，其编码前一方面所述的蛋白酶K突变体。

在一个或多个实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的的多核苷酸。

在一个或多个实施方式中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

在一个或多个实施方式中，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞等。

在一个或多个实施方式中，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等。

在本发明的另一方面，提供一种提高蛋白酶K的耐盐性或稳定性的方法，包括对其进行突变改造，对应于SEQ ID NO:1所示的蛋白酶K，对选自下组的位点或位点组合进行突变：第266位、第279位；所述位点突变为亲水性或中性氨基酸。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的蛋白酶K突变体的制备方法，该方法包含：(i)培养所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述的蛋白酶K突变体的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的蛋白酶K突变体。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的蛋白酶K突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于酶解蛋白质；较佳地，其被用于特异性识别和切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，酶解蛋白质。

在本发明的另一方面，提供一种酶解蛋白质的方法，包括：利用前面任一所述的蛋白酶K突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行酶解反应。

在本发明的另一方面，提供一种用于酶解蛋白质的检测体系或检测试剂盒，其中含有：前面任一所述的蛋白酶K突变体，表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物。