[发明专利]一种天冬酰胺酶突变体及其基因、工程菌和制备方法

说明书

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种酶活力提高的L‑天冬酰胺酶突变体及其制备。本发明通过分子生物学技术手段获得蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)野生型的L‑天冬酰胺酶基因，利用易错PCR技术对野生型L‑天冬酰胺酶基因进行随机突变，得到L‑天冬酰胺酶突变体Y55S/I203V、H8R/Y55S/I203V，及其编码基因asnm1、asnm2，重新构建重组质粒，并实现了其在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得高活力的L‑天冬酰胺酶。

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及通过易错PCR技术体外定向进化获得酶活力提高的L-天冬酰胺酶突变体及其制备与应用。

背景技术：

L-天冬酰胺酶(L-Asparaginase；EC 3.5.1.1；ASN)是专一催化L-天冬酰胺水解脱氨基生成L-天冬氨酸和氨的一种水解酶。大多数天冬酰胺酶具有3％-9％的谷氨酰胺酶活性，催化L-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨。L-天冬酰胺酶来源比较广泛，豚鼠血清、植物以及微生物中都发现该酶的存在。L-天冬酰胺酶有L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II这两种不同的构型。I型酶的结构为二聚体，一般在细胞内且对底物具有低亲和力；而II型酶为四聚体，位于细胞周质对底物具有高亲和力，研究表明只有II型酶具有抗肿瘤活性。L-天冬酰胺酶通过催化反应使机体内的L-天冬酰胺含量下降。机体内恶性细胞合成L-天冬酰胺的能力比正常细胞缓慢，并且需要外源补给，而正常的细胞因为具有合成L-天冬酰胺的能力，当外界L-天冬酰胺含量下降时可以不受影响。如今，L-天冬酰胺酶现已经被制成药剂，成为抗癌新药之一，美国、日本以及德国等国家均已经有该酶产品出售。从E.coli，Erwiniachrysanthemi等细菌中分离纯化的L-天冬酰胺酶II已经被广泛应用于治疗急性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤及网状细胞肉瘤等疾病。此外，近年来研究发现L-天冬酰胺酶还可以减少油炸食品中丙烯酰胺的生成。1994年国际癌症机构(IARC)证明丙烯酰胺具有致癌作用。在磷酸盐缓冲液中加入一定量的葡萄糖和L-天冬酰胺并在185℃反应，测定结果表明有大量丙烯酰胺生成。碳水化合物丰富的食物加工温度高于120℃，分析检测其丙烯酰胺含量为1mg/kg，餐馆食物中的丙烯酰胺含量可以达到4mg/kg。美拉德反应与加工食品风味物质及色泽形成有关。食品加工过程中丙烯酰胺的形成是通过美拉德反应产生的，氨基酸和还原糖在高温下会发生美拉德反应，而且L-天冬酰胺可以提供氨基，土豆及其他谷物中的L-天冬酰胺是生成丙烯酰胺的重要前体。2008研究报道表明，卵巢癌、子宫癌、乳腺癌及肾肿瘤的发病率提高与长期食用高含量丙烯酰胺的食物有关系。因此，学者们致力于减少食物中丙烯酰胺的形成，相关报道也越来越多。

对酶分子的设计与改造方面，是基于基因工程、蛋白质工程和计算机技术互补发展和渗透的结果，它标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至设计出自然界中原来并不存在的全新的酶分子。酶分子人为改造还不成熟的情况下，通过定点突变技术改造成功了大量的酶分子，获得了比天然酶活力更高、稳定性更好的工业用酶。近年来，易错PCR、DNA改组(DNA shuffling)等技术的应用，在对目的基因表型有高效检测筛选系统的条件下，建立了酶分子的定向进化策略，尽管不清楚酶分子的结构，仍能获得具有预期特性的新酶，基本实现了酶分子的人为快速进化。

芽孢杆菌表达系统作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。它与常用的大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等均可作为表达宿主菌。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究也十分清楚，具有密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、不产生致病毒素、对培养基无特殊要求等优点。随着分子生物学技术的发展和芽孢杆菌研究的深入，使用芽孢杆菌表达系统已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，多种酶和临床需要的化学药品或者工业产品都通过芽孢杆菌来表达生产。