[发明专利]一种利用抗冻蛋白-内含肽作为纯化标签实现重组蛋白纯化的方法和应用

说明书

本发明公开了一种利用抗冻蛋白‑内含肽序列作为纯化标签实现外源重组蛋白分离纯化的方法和应用，属于生物技术领域。该方法包括：(1)构建带有抗冻蛋白‑内含肽纯化标签和重组蛋白基因的重组质粒，将其转入表达宿主细胞，获得重组工程菌；(2)培养重组工程菌，诱导外源蛋白表达；(3)细胞破碎后用冰作为吸附介质从细胞破碎上清液中一步分离纯化带有抗冻蛋白‑内含肽纯化标签的融合蛋白，之后诱导内含肽的N端发生断裂反应，释放目的蛋白，经过透析后再次用冰吸附去除纯化标签从而得到去除纯化标签的目的蛋白。本发明提供了一种低成本、无需色谱柱和色谱填料、操作简单、去除纯化标签的实现外源重组蛋白分离纯化的方法及应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种利用抗冻蛋白-内含肽序列作为纯化标签实现外源重组蛋白分离纯化的方法和应用。

背景技术

目前异源表达的重组蛋白常用亲和色谱进行分离纯化，该方法通常利用基因重组技术将亲和标签与目的蛋白融合表达，之后用偶联有特定配基的色谱填料一步纯化获得较高纯度的重组蛋白，具有条件温和、特异性好、适用范围广等优点。目前常用作亲和标签的多肽或蛋白主要包括多聚组氨酸、麦芽糖结合蛋白、小泛素相关修饰蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶等。然而，利用亲和色谱纯化重组蛋仍然存在一些局限，如：(1)纯化过程需要使用较为昂贵的色谱填料和色谱柱；(2)对于一些蛋白，带有亲和标签会影响其功能活性，因此需要用蛋白酶切除亲和标签，不仅需要使用昂贵的蛋白酶，而且需要额外的分离过程去除蛋白酶和标签片段。上述局限导致工业上利用亲和色谱纯化重组蛋白的成本较高且耗时较长，不利于规模化生产过程。因此，发现和利用自然界中特定生物大分子间的特异性相互作用，开发新型纯化标签，建立低成本、操作简便、易切除标签序列的纯化方法具有重要意义。

抗冻蛋白(Antifreeze Protein，AFP)是一类能特异性结合到冰晶表面抑制其进一步生长，并且能降低水溶液的冰点但对熔点影响较小从而产生热滞效应的蛋白质，它们最初发现于极地海洋鱼类的体内。AFP与冰的结合作用是一种涉及分子间氢键、疏水相互作用、范德华力的特异性受体-配体相互作用，结合强度较高，而将冰融化即可实现AFP与冰的分离。来源于南极鱼Lycodichthyus dearborni的AFP是一种分子量约为7kDa的球蛋白，不仅能特异性结合冰晶，而且具有较好的温度和pH稳定性。利用AFP的冰结合特性，研究人员建立了以冰为吸附介质纯化AFP的方法，包括使用带有温控系统的“手指”插入到细胞破碎上清液中，或将细胞破碎上清液倒入预先形成冰壳的圆底烧瓶中进行吸附从而纯化AFP。

内含肽是未成熟前体蛋白中的一段序列，其通过重排、转酯、环化等自催化过程将自身切除并将紧邻内含肽N端和C端的多肽链通过一个新形成的肽键连接，形成成熟蛋白。将内含肽的N端或C端关键氨基酸残基突变后可以将原来的剪接反应转变为特定末端的断裂反应。如源自蟾分枝杆菌Mycobacterium xenopi gyrA基因的内含肽Mxe GyrA经过N198A突变后，C端不能发生断裂反应，但加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)可以诱导N端发生断裂反应。由于内含肽能在特定溶液微环境中发生自催化剪接/断裂反应，反应条件温和且无需蛋白酶，因此在酶工程、合成生物学、蛋白分离纯化领域具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用抗冻蛋白-内含肽序列作为纯化标签实现外源重组蛋白分离纯化的方法和应用，从而解决现有重组蛋白纯化技术中需要昂贵的色谱填料和色谱柱、切除标签序列需要使用蛋白酶进一步增加成本和分离步骤，导致分离纯化成本高、流程复杂、难以规模化等问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种利用抗冻蛋白-内含肽作为纯化标签实现外源重组蛋白分离纯化的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建含有抗冻蛋白-内含肽纯化标签的基因和待分离纯化的外源重组蛋白基因的重组表达载体，再将该重组表达载体转入表达宿主细胞，获得重组工程菌；