[发明专利]一种高产乳酰-N-新四糖的微生物的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种高产乳酰‑N‑新四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明过表达β‑1,3‑乙酰葡萄糖胺转移酶，β‑1,4‑半乳糖基转移酶和/或UDP‑葡萄糖4差向异构酶的编码基因，使其拥有生产乳酰‑N‑四糖的合成能力。本发明通过筛选高效的β‑1,4‑半乳糖基转移酶基因，并通过组合调控乳酰‑N‑新四糖合成途径中lgtA，Aa‑β‑1,4‑GalT和galE的表达，从而精确调控代谢通路的碳通量，缓解代谢压力。在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑新四糖的能力为0.91 g/L，在3 L发酵罐中，乳酰‑N‑新四糖的产量达到12.14 g/L，具备工业应用的前景。

技术领域

本发明涉及一种高产乳酰-N-新四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术

母乳通常被认为是提供婴儿营养的最重要的来源。作为母乳中含量仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分，对于婴幼儿有益肠道菌群的生长以及预防病原菌与上皮细胞的粘附，母乳寡糖的合成发挥着重要的作用。已经报道的母乳寡糖的种类有两百多种，主要分为三大类，唾液酸化，岩藻糖基化和非岩藻糖基化的中性母乳寡糖，并分别占比12-14％，35-50％和42-55％。其中占比最高的非岩藻糖基化的中性母乳寡糖，主要包括乳酰-N-四糖和乳酰-N-新四糖，分别占总的母乳寡糖的6％。大量文献集中报道这两种中性四糖对婴幼儿的健康具有明显的促进作用，且乳酰-N-四糖和乳酰-N-新四糖都已经被美国FDA和EU批准作为添加剂添加到婴幼儿奶粉中。因此受到广泛关注。但是目前乳酰-N-四糖和乳酰-N-新四糖的生产成本较高且生产方法有一定局限性。

目前乳酰-N-新四糖可以通过化学合成和生物合成获得。化学法合成通常需要引入保护基团，步骤繁冗，且存在保护不到位，后续脱除不彻底及发生其他副反应的问题，而且常需要使用有毒有害试剂。相比之下，生物法合成由于酶与底物的特异性高，底物廉价，合成步骤简化，副产物少，产率大大提高，更适合大规模的工业化生产。目前主要是采用微生物发酵法来合成乳酰-N-新四糖。微生物发酵法合成乳酰-N-新四糖需要一个关键的能催化前体乳酰-N-三糖II转化的β-1,4-半乳糖基转移酶。目前仅有一个来源于脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)的编码β-1,4-半乳糖基转移酶的基因(lgtB)被研究并应用于乳酰-N-新四糖的生产。最近，通过对两个关键基因lgtA(编码β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶)和lgtB进行染色体整合，改造了枯草芽孢杆菌以产生乳酰-N-新四糖(LNnT)，经过优化步骤后，工程菌株同时生产了乳酰-N-新四糖(LNnT)和乳酰-N-三糖II，在分批培养中的滴度分别为4.52-5.41和2.64-2.98g/L(Dong XM,Li N,Liu ZM,et al.Modularpathway engineering of key precursor supply pathways for lacto-N-neotetraoseproduction in Bacillus subtilis.Biotechnol Biofuels.2019；12(1):212.和Dong XM,Li N,Liu ZM,et al.CRISPRi-Guided multiplexed fine-tuning of metabolic fluxfor enhanced lacto-N-neotetraose production in Bacillus subtilis.JAgric FoodChem.2020；68(8):2477-2484.)。但目前使用的微生物方法合成的乳酰-N-新四糖产量均较低，目前已报道的β-1,4-半乳糖基转移酶可能是一个限制因素，都不能达到工业化大规模生产的要求，因此，为了解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是非常必要的。

发明内容