[发明专利]一种基于网状杂交链式反应的基因链检测方法

说明书

本发明公开了一种基于网状杂交链式反应基因链检测方法。包括：(1)提取总RNA：从待检测的样本中提取总RNA；(2)逆转录滚环扩增；(3)网状杂交链式反应探针设计；(4)网状杂交链式反应；(5)荧光信号测定。该方法不仅可以灵敏且特异的检测生物样本中的环状RNA，对于了解环状RNA的生物学功能和追踪疾病进程有重要意义，而且还适用于一些含有多段重复序列的基因检测，如对端粒DNA也有应用潜力。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于网状杂交链式反应的基因链特异性检测方法。

背景技术

环状RNA(circRNA)作为一类新出现的生物标志物，它在多种疾病的发生发展中扮演着非常重要的角色，特别是在癌症中。一些特定的环状RNA在肿瘤与正常组织中的表达量有着显著的差异。多项研究表明环状RNA可以通过多种机制参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。然而，近年来检测方法的局限性却严重限制了circRNA的相关研究。

到目前为止，大多数对环状RNA的研究都是基于测序方法，虽然可以获得转录组的信息，但是依旧迫切需要定量临床样品中特定环状RNA的策略。几种传统的分子生物学方法也已经用于环状RNA的检测，包括凝胶电泳，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，荧光原位杂交(FISH)等。近年来一些新兴的环状RNA检测技术进入人们视野。环介导的等温扩增(LAMP)技术、双链特异性核酸酶(DSN)、滚环扩增(RCA)都被用于circRNA的检测。

传统的凝胶电泳只能以极低的灵敏度区分环状RNA和线性RNA。RT-qPCR虽然能够实现对环状RNA的灵敏检测，但是逆转录过程中的滚环扩增会导致丰度的伪增加。FISH技术可用于直接的环状RNA原位检测，但它产生的检测信号低，需要先进的显微镜来获取。而新兴的环状RNA检测技术则普遍存在着假阳性问题，以及引物设计的困难。而且，大多数都依赖于RNase R的富集处理。考虑到circRNA的独特结构和极低的表达水平，对circRNA检测方法的不断改进是必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于网状杂交链式反应基因链检测方法，该方法不仅可以灵敏且特异的检测生物样本中的环状RNA，对于了解环状RNA的生物学功能和追踪疾病进程有重要意义，而且还适用于一些含有多段重复序列的基因检测，如对端粒DNA也有应用潜力。

一种基于网状杂交链式反应的基因链检测方法，针对circRNA的检测步骤如下：

(1)提取总RNA：从待检测样本中提取总RNA；

(2)逆转录滚环扩增：针对要检测的目标circRNA，在非反向剪切位点的靶序列处选取碱基设计特异性逆转录引物；优选18-25个碱基设计，进一步优选20个碱基设计特异性逆转录引物；该引物特异性识别目标circRNA，用不含RNase H的高效逆转录酶进行滚环逆转录，逆转录得到一条长的具有多组重复序列的cDNA单链(图1a)(至少2个重复序列，优选3-10个重复序列)，该cDNA链上含有多个逆转录后的反向剪切位点序列；而相应的线性RNA则无法进行持续的逆转录(图1b)；此外，首尾相连的线性RNA仅可以逆转录得到带有一组反向剪切位点的cDNA。通过circRNA的RT-RCA过程对目标circRNA进行第一次的筛选与扩增，实现第一次的信号放大。

(3)网状杂交链式反应探针设计：CircRNA与其线状异构体具有相同的主体序列，二者区别在于反向剪切位点(Backsplice junction)处的序列不同。针对cDNA链上存在的多个逆转录后的反向剪切位点序列，设计三个HCR探针：Trigger、H1、H2；Trigger用来识别逆转录后的反向剪切位点序列并启动网状杂交链式反应，探针H1、H2进行DNA网状纳米结构的搭建；(图1c)

(4)网状杂交链式反应：将探针Trigger、H1与H2同逆转录滚环扩增得到的cDNA链在一定温度下共孵育；

(5)荧光信号测定：通过对荧光信号的检测，实现对circRNA的检测；