[发明专利]一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用。本发明提供了一种制备成纤维细胞外泌体的方法，包括：将成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；收集培养上清，并分离纯化得到成纤维细胞外泌体。本发明基于氧浓度梯度培养技术，极限刺激成纤维细胞的增殖能力和应激分泌功能性外泌体的潜能，通过离心浓缩、纳米膜过滤分离富含细胞外泌体的上清原液和细胞裂解液，最大限度保留细胞培养上清中促进细胞生长的营养成分和活性因子，去除其他大分子蛋白、细胞碎片等难吸收成分，并加入具有消炎保湿作用的积雪草苷、玻尿酸等，具有多重修复护理功效，改善皱纹修复的微环境。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用。

背景技术

皱纹是由于皮肤真皮层内的胶原蛋白、透明质酸、弹性纤维等物质缺失，无法支撑皮肤的正常架构，皮肤表皮层随之塌陷形成沟壑而形成的。成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，常附着在胶原纤维上，能合成和分泌大量胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维及有机基质，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用。

外泌体(exosomes)是一种由多种细胞在正常或病理状态下分泌的微小囊泡，具有脂质双层膜结构，内含复杂的RNA和蛋白质，功能取决于其来源的细胞类型，在机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、细胞间信息传递、组织稳态调控等方面发挥重要作用。与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用。

第一方面，本发明要求保护一种制备成纤维细胞外泌体的方法。

本发明要求保护的制备成纤维细胞外泌体的方法，可包括如下步骤：

(I)将成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％(空气标准含氧量)，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％(空气标准含氧量)；

(II)收集经步骤(I)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞的培养上清，并分离纯化得到成纤维细胞外泌体。

其中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。

在本发明的具体实施方式中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。

在本发明中，所述氧气浓度均指体积百分含量。

在步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，培养时间均可为10-14h(如12h)；CO₂的浓度均可为5％(体积百分含量)；培养温度均可为37℃；采用的培养基均可为无血清干细胞培养基。在本发明的具体实施方式中，所述无血清干细胞培养基具体为TheraPEAK^TM MSCGM-CD^TM Mesenchymal Stem Cell Medium,Chemically Defined(中文名称：TheraPEAK^TM MSCGM-CD^TM人间充质干细胞培养基)，产品编码：YS000471，供应商：LONZA公司。

步骤(I)中，将所述成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还可包括如下步骤：将所述成纤维细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。然后再进行PBS洗涤(如洗涤两次)。

步骤(II)中，可按照包括如下步骤的方法分离纯化得到所述成纤维细胞外泌体：收集所述成纤维细胞的培养上清，反复冻融，4℃2000g离心8-10min，然后将离心所得上清液过滤，所得滤液中即含有成纤维细胞外泌体。