[发明专利]一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种制备成纤维细胞外泌体的方法，包括如下步骤：

(I)将成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％；

(II)收集经步骤(I)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞的培养上清，并分离纯化得到成纤维细胞外泌体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，培养时间均为10-14h；和/或

步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，CO₂的浓度均为5％；和/或

步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，培养温度均为37℃；和/或

步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，采用的培养基均为无血清干细胞培养基；和/或

步骤(I)中，将所述成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还包括如下步骤：将所述成纤维细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(II)中，按照包括如下步骤的方法分离纯化得到所述成纤维细胞外泌体：收集所述成纤维细胞的培养上清，反复冻融，4℃2000g离心8-10min，然后将离心所得上清液过滤，所得滤液中即含有成纤维细胞外泌体；

进一步地，所述将离心所得上清液过滤为：先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞外泌体粗提液，再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞外泌体精提原液。

6.利用权利要求1-5中任一所述方法制备得到的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液。

7.一种用于修复皱纹的滋润营养精华液，由分别独立包装的B液和D液组成，或者由所述B液和所述D液等体积混合而成；

所述B液为权利要求6所述的成纤维细胞外泌体精提原液；

所述D液按照包括如下步骤的方法制备得到：

(A)按照权利要求1-4任一中的步骤(I)，将成纤维细胞置于所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；

(B)收集经步骤(A)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞，反复冻融，4℃2000g离心8-10min，然后将离心所得上清液先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞裂解粗提液，再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞裂解精提液，即为所述D液。

8.一种用于修复皱纹的成套产品，由权利要求7所述滋润营养精华液和基底液组成；所述基底液组成如下：积雪草苷0.92％质量百分含量，玻尿酸0.26％体积百分含量，甘油0.12％体积百分含量，橄榄油0.15％体积百分含量，余量为生理盐水。

一种用于修复皱纹的成纤维细胞外泌体敷贴，按照包括如下步骤的方法制备得到：在无菌条件下，将所述基底液附着于蚕丝布表层，再将蚕丝布浸润入权利要求7中由所述B液和所述D液等体积混合而成的所述滋润营养精华液中，浸润时间为12hs，浸润环境保持4℃，获得所述成纤维细胞外泌体敷贴。