[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a的猪链球菌快速可视化RPA检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a的猪链球菌快速可视化RPA检测试剂盒及其应用。所述试剂盒中包含一对用于扩增猪链球菌cps2j基因的特异性引物对、gRNA和荧光报告探针，其中，所述的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:6和7或SEQ ID NO:8和9所示，与所述的gRNA互补的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或3所示。本发明根据猪链球菌的特异性基因Cps2j设计特异性重组酶聚合酶扩增(RPA)引物及CRISPR/Cas12a系统探针，实现了RPA特异性靶基因扩增，以及CRISPR/Cas12a系统对报告基因的切割，建立了猪链球菌的快速可视化检测方法。该方法快速，可视，且特异性好，敏感度高，特别适用于资源贫乏地区猪链球菌的检测。

技术领域

本发明涉及一种猪链球菌检测试剂盒及其应用，特别涉及基于一种基于CRISPR-Cas12a的猪链球菌快速可视化RPA检测试剂盒及其应用。本发明属于医学检测技术领域。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是引起猪链球菌病的主要病原，能够导致猪淋巴结脓肿和败血性链球菌病，以败血症、脑膜炎、关节炎、化脓性淋巴结炎和猝死为主要特征。各种日龄猪均可感染，一年四季均可发生。随着我国规模化养猪业的发展，猪链球菌病已成为养猪生产中的常见病和多发病，特别是近十多年来，其发病率不断升高，给我国以及世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪链球菌还是一种人兽共患病病原，能够引起人类感染。因此，为了有效预防和控制猪链球菌感染的爆发，对猪链球菌的检测，特别是早期检测，对养猪产业和公共卫生均具有重要的意义。

猪链球菌属于链球菌属，革兰氏染色阳性，多数有荚膜，无鞭毛。菌体呈圆形或椭圆形，一般呈链状或成对排列。多数为兼性厌氧，少数为厌氧菌。最适生长温度为37℃，pH7.4-7.6，菌落较小，呈灰白色透明，在羊血琼脂平板上生长时，呈现α溶血。根据荚膜抗原的差异，猪链球菌分为29个血清型，不同血清型致病力之间存在差异。猪链球菌的自然感染部位是上呼吸道(主要是扁桃体和鼻腔)、消化道和生殖道。猪链球菌是一种机会性致病菌，在猪场中的检出率非常高。猪群之间的感染通常是因为病猪和健康带菌猪只的流动而发生，病猪和健康带菌猪的排泄物和分泌物中均有猪链球菌，猪只直接接触或接触带病原菌的污染物(饮水、饲料及圈舍物体)均可引起猪群的大批发病，进而造成流行。各日龄猪都具有易感性，仔猪多发生败血症和脑膜炎，中猪则多发化脓性淋巴结炎。一年四季均可发生，春秋多发，呈地方性流行。在规模化猪场，猪链球菌感染常常造成病毒性疾病如猪繁殖和呼吸障碍综合征、猪瘟等的继发病。人感染猪链球菌主要通过生食猪肉制品和皮肤伤口，造成细菌性脑膜炎或引起中毒样休克综合征。

猪链球菌进化出了多种致病因子，在其对宿主的黏附、入侵和定殖中发挥重要作用，这些致病因子在猪链球菌鉴定中也具有重要地位。目前从猪链球菌中已经鉴定到几十种致病因子，包括荚膜(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外因子(EF)、溶血素(SLY)、细菌表面蛋白、纤维蛋白结合蛋白等，但公认对其毒力具有重要贡献的主要有CPS和SLY。编码合成CPS的关键蛋白基因wzy由于具有血清型特异性，目前被广泛用来鉴定猪链球菌的血清型。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种灵敏度高，特异性强、反应迅速的诊断技术，其灵敏性可以准确到单个细菌。因此，在诊断应用方面得到了广阔的发展。目前，基于PCR技术已经建立了多种方法用于早期诊断猪链球菌病及菌株的鉴定。这些方法无论足在灵敏度还是在特异性上，都具有其它方法不可比拟的优势，然而这种方法繁琐，不仅需要相关专业操作培训，还需采购PCR仪、照胶仪等体积较大、价格昂贵的设备。

在PCR方法基础上，通过引入荧光标记的探针，可以实时检测靶标的扩增情况，称为Real-time PCR。Real-time PCR不仅是快速、高灵敏的检测方法，同时这种方法也可以进行定量分析。但是仍需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，且耗时较长，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。