[发明专利]一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用，所述试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜两端分别设有样品垫和吸水垫，所述样品垫、吸水垫和硝酸纤维素膜均置于底板上，其特征在于，所述硝酸纤维素膜设有检测线和控制线，所述检测线含有恙虫病东方体混合重组抗原，所述质控线含有兔抗恙虫病东方体多克隆抗体。本发明采用双抗原夹心法实现对恙虫病东方体抗体的检测，具有检测仪器成本低，操作简单，快速，稳定性好，特异型好，灵敏度高，实用性较强、容易保存、具有市场开发价值。

技术领域

本发明属于荧光免疫检测技术领域，具体涉及一种双抗原夹心法检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

恙虫病是由恙虫病东方体(Orientia tsutsμgamushi，Ot)所引起的自然疫源性疾病。恙螨幼虫是恙虫病惟一的传播媒介，恙螨幼虫通过叮咬鼠类等啮齿类动物形成自然界的感染循环。恙虫病东方体跟随恙螨的咬噬而进入人体，先在皮肤叮咬处开始繁衍，再进入血液，最初攻击的是破损部位的髓样细胞，进而攻击血管内皮细胞。之后恙虫病东方体利用宿主细胞上存在的表面蛋白聚糖和菌体表面蛋白将其自身附着到靶细胞上。恙虫病在我国分布极为广泛，受地理地貌、气候、野生动物影响很大，不同菌株和不同地区的恙虫病东方体抗原性和毒力又存在差异，恙虫病的致病机制也尚未完全明确，辅助检查无特异性，导致该病的预防和诊断仍面临较大困难。

目前，恙虫病的检测方法主要分为两大类，一是免疫学检测方法，二是针对病原体核酸的检测方法。免疫学方法主要包括间接免疫荧光法(IFA)、外斐氏反应、酶联免疫吸附法(ELISA)等。IFA方法具有一定的局限性：成本高昂、操作复杂、检测操作需要专业培训、试剂生产也需要相应的生物安全防护设施，因而IFA在疫区的应用有限。外斐氏反应凝集试验该方法的灵敏度和特异性都无法满足临床要求。ELISA的灵敏度较高，而且检测结果为具体数值，可以进行相对定量，制作成本低，可以进行高通量检测，但是ELISA依然存在着不少问题：操作步骤繁琐、容易出现污染、需要专业人员进行操作等。针对病原体核酸的检测方法，包括普通PCR，荧光定量PCR，环介等温扩增试验(LAMP法)，重组聚合酶反应(RAP法)等。整体来说，PCR技术诊断的准确性是优于其他方法对于早期恙虫病的诊断，但是也存在着一些急需改进的问题，如实时PCR针对56-KDa抗原检测具有高速特异性但序列变异性可能改变引物的退火温度，从而降低实验的灵敏度。另外PCR法需要专门的仪器设备以及相应的基础设施，在体系配置阶段又容易产生污染，同时也需要专业人员进行操作。

免疫层析技术是一种将色谱层析技术、免疫学技术以及免疫标记技术相结合的固相膜免疫分析技术。通常是根据标记物的光学特性等获得可观察或测量的信号，最终判定检测结果。它的诊断原理是：样品溶液借助毛细作用在硝酸纤维(NC)膜上泳动，层析时标记物与待测物的复合物被相应的配体捕获而浓集显色，以NC膜上显色条带的有无或多少来定性或定量分析。

近年来，随着免疫层析技术的发展加上具有携带方便、操作简单且敏感性、特异性高等特点，胶体金免疫层析试纸条开始应用于恙虫病的诊断。目前，国外已报道有三个商品化的胶体金免疫层析试纸，澳大利亚Panbio公司产品，以Karp标准株重组蛋白为诊断抗原；美国的Access Bio公司产品，以Karp、Gilliam和Kato株混合重组抗原作为诊断抗原；美国InbBios公司产品，以Karp、Gilliam、Kato和TA716混合重组抗原作为诊断抗原。但胶体金试纸条的T/C线最终为红色线条，在血清的检测过程中会受到血清背景颜色的干扰，影响实验的准确结果，且胶体金在日光下进行读取，灵敏度有一定的局限性。荧光微球是在受到激发光的激发后发出肉眼可见的荧光，抗干扰能力强，降低信噪比，具有更高的灵敏度。