[发明专利]制备水凝胶支架的方法及由此得到的支架的用途

说明书

本发明涉及一种利用自组装多肽制备水凝胶支架的方法及由此得到的支架的用途，该制备方法包括：1)将自组装肽序列通过共价键键合神经生长因子模拟肽，得到键合功能多肽；2）分离并培养巨噬细胞，并诱导其为“替代性激活”的抗炎M2巨噬细胞，获得培养上清液并进行过滤；3）将得到的经过滤的细胞培养上清液与所述键合功能多肽混合，得到混合液并调整该混合液的浓度，所述键合功能多肽自组装形成水凝胶支架。本发明的制备方法采用M2巨噬细胞条件培养上清液构建再生微环境，结合多肽功能水凝胶支架，实现较好的整体相互作用，制备得到可以补充和调节神经再生的水凝胶支架，该支架可以促进神经细胞再生行为，为组织工程生物材料提供新的选择。

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，更具体而言，涉及一种利用自组装多肽制备水凝胶支架的方法以及由此得到的支架的用途。

背景技术

周围神经损伤的主要原因包括交通事故、机械创伤、自然灾害和手术意外。我国周围神经损伤病例每年新增约100万例，所照成难以恢复的残疾严重影响患者的生活质量和心理健康，为家庭和社会带来了沉重的经济负担。同时，本领域已知人工神经植入物的修复效果与自体神经相比还有差距，通过局部再生微环境调控提高植入物的功能，是能否实现临床应用的关键问题。

组织工程技术的出现，为损伤神经修复提供了技术方式。组织工程包括三个要素：支架、种子细胞和信号因子。其中支架对于不仅对于再生组织起到物理连接和支持作用，而且在调控细胞再生环境发挥了重要作用。水凝胶的三维网络结构具有含水量高、适宜细胞生长的特点，通过交联生长因子模拟肽进一步提高了细胞生长环境，因此，如何成功地构建能够良好地模拟体内微环境的支架材料，对于损伤神经再生而言具有重要意义。

巨噬细胞在体内分布极广，在调节炎症过程中发挥着巨大作用，具有高度可塑性，并在机体的发育及内环境的平衡中起到重要作用。巨噬细胞发生极化为M2表型后，极化后的巨噬细胞亚型可以细致调节及回应各种不同的刺激，分泌信号因子，抗慢性炎症，促进组织修复再生，对疾病组织器官的修复程度起着关键性的作用。关于M2巨噬细胞衍生的细胞外基质构建水凝胶支架的研究还未见报道，具有重要的研究价值。

发明内容

本发明的一个方面是提供一种自组装多肽水凝胶支架制备方法，其中，所述方法包括：

（1）将自组装肽序列通过共价键键合神经生长因子模拟肽，得到键合功能多肽；

（2）分离并培养巨噬细胞，并诱导其为“替代性激活”的抗炎M2巨噬细胞，得到细胞培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；

（3）将所述经过滤的细胞培养上清液与所述键合功能多肽混合，得到混合液并调整所述混合液的浓度，所述键合功能多肽自组装形成水凝胶支架。

优选地，神经生长因子模拟肽具有促进神经血管细胞再生的功能。

优选地，自组装肽序列与神经生长因子模拟肽通过酰胺键或二硫键共价连接。

优选地，自组装肽序列与神经生长因子模拟肽摩尔比为（1~3）：1。

优选地，巨噬细胞来自大鼠/小鼠腹腔或骨髓、或人外周血单个核淋巴细胞中的一种。

优选地，步骤（2）所述培养在30℃~40℃、3%~10% CO₂的条件下进行；进一步优选地，所述培养的过程包括：将所述巨噬细胞在培养基中生长至60%~80%的汇合度后，弃去培养液并利用PBS缓冲液进行洗涤，随后向洗涤后的培养物中加入新鲜培养基并继续培养36h以上、例如36~72h、优选40~50h；

优选地，采用孔径为0.2~0.45μm的过滤材料对所述细胞培养上清液进行过滤。

优选地，M2巨噬细胞培养上清液的制备方法，其特征在于，所述细胞培养诱导物采用10ng/ml的 IL-4进行步骤（2）所述的诱导。