[发明专利]一种富含L-异亮氨酸的蛋白肽的生产方法

权利要求书

1.一种富含L-异亮氨酸的蛋白肽的生产方法，其特征在于：包括真空蒸发循环发酵培养、发酵液菌体灭活、发酵液酶解、浓缩以及喷雾干燥，具体步骤如下：

(1)L-异亮氨酸真空蒸发循环发酵

活化培养：从-80℃冰箱中取出保菌管，取两环异亮氨酸生产菌菌液接种到试管斜面培养基上，培养箱中32℃活化培养24h，再取两环生长良好的活化菌接种到茄形瓶斜面培养基上，接两个，培养活化24h；

种子培养：用200ml无菌水洗茄形瓶，将菌液全部接种到5L发酵罐中进行种子培养，培养条件为32℃，维持pH6.7-7.0，其他条件不变，种子液培养至OD_600nm15-25时，接发酵培养基进行发酵培养；

发酵培养：30L发酵罐发酵培养，初始发酵体积14L，20％接种量接种于发酵罐，发酵液连续培养60h；温度32℃，pH6.7-7.0，溶氧保持在30％-40％之间，转速由200r/min逐步提加到900r/min；通风由7.0L/min逐步提升到15.0L/min；16h后测残糖，流加80％的葡萄糖，维持残糖在1.0％-2.0％之间；中间添加适量泡敌消除泡沫；发酵18h、32h、42h分别补加70g脱硫玉米浆；当发酵至20h时，发酵液从发酵罐通过压力差以300-350mL/min的流速打入真空刮板浓缩器中进行真空膜式蒸发，浓缩后的发酵液在刮板浓缩器下方的缓冲区，浓缩液液面达到上面液位电极处时，停止进料并关闭真空，浓缩液由无菌空气加压再打入发酵罐，如此反复，同时利用无菌水定容至浓缩前体积，去除大部分的乙酸及NH₄⁺；选择利用60-70℃的热水作为蒸发的热源，真空度为600mmHg；

(2)发酵液加热灭活

通过步骤(1)发酵培养获得的发酵液，用氢氧化钠调节pH至11.0，90℃保温30分钟；使得菌体裂解，得到变性菌体蛋白；

(3)复合蛋白酶超声酶解

将步骤(2)得到的菌体裂解液倒入超声酶解罐中，加入0.3％复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶组成，其中按重量比计胰蛋白酶占总酶总量的80％、木瓜蛋白酶占总酶总量的10％、胃蛋白酶占总酶总量的5％、中性蛋白酶占总酶总量的5％；超声破碎条件是300W，工作10s停10s，20min；

(4)酶解液减压浓缩

减压浓缩采用四效降膜蒸发器偶联刮板浓缩器的浓缩方式进行高浓缩比浓缩，蒸汽压力0.09MPa，真空度0.08MPa，浓缩固形物含量为30％；

(5)喷雾干燥

喷雾干燥机进风温度300℃，出风温度100℃，风压700Pa，干燥时间15s，得到成品异亮氨酸复合蛋白肽。

2.根据权利要求1所述的富含L-异亮氨酸的蛋白肽的生产方法，其特征在于：所述步骤(1)中种子培养采用的斜面培养基配方为：葡萄糖1g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，琼脂20g/L。

3.根据权利要求1所述的富含L-异亮氨酸的蛋白肽的生产方法，其特征在于：所述步骤(1)中发酵培养采用的发酵培养基配方为：葡萄糖60g/L，MgCl₂ 0.5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，豆粕粉5g/L，豆粕盐酸水解液10ml/L，脱硫玉米浆干粉20g/L，V_H 0.1mg/L，V_B1 0.3mg/L，泡敌0.2g/L，用40％的NaOH溶液调节pH到4.5-5，培养过程用氨水调节并维持pH到6.7-7.0。