[发明专利]一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用

说明书

本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用；通过在大肠杆菌中表达重组SARS‑COV‑2病毒N蛋白并进行纯化，采用纯化的重组核蛋白进行动物免疫，获得可稳定分泌抗SARS‑CoV‑2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6，并利用nCoVN3G6单克隆抗体建立了新冠捕获法IgM ELISA、双抗体夹心法ELISA检测新冠病毒抗原、胶体金检测新冠病毒抗原的试剂盒、时间分辩荧光层析检测新冠病毒抗原试剂盒，为今后SARS‑COV‑2病毒感染的诊断、感染机制及疫苗开发的研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。SARS-CoV-2属于冠状病毒科β冠状病毒属，是一种有包裹的正链单链RNA病毒，直径约80-120nm，病毒基因组含29844个碱基，编码的病毒结构蛋白主要有刺突(Spike，S)蛋白，膜(membrane,M)蛋白和核衣壳(Nucleocapsid, N)蛋白。新型冠状病毒感染引起的疾病称为2019冠状病毒病(COVID-19)，感染的症状可从轻度或极小的呼吸症状到急性呼吸窘迫综合征(ARDS)甚至死亡，目前对于COVID-19没有特异治疗方法。早期快速诊断是防治的关键，对控制院内感染，切断疾病传播等至关重要。

目前，RT-PCR已成为诊断COVID-19的金标准，但是研究表明此方法对操作人员和实验室条件有很高的要求，此外，无症状感染者出现，且部分患者在疾病发作后病毒载量较低，因此迫切需要一种基于COVID-19的病毒抗体的免疫学检测方法作为补充。

现有申请号为CN202010564744.1的专利文件公开了一种可分泌新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体，其是将SARS-CoV-2的N蛋白用生理盐水稀释后与Quick Anti-body-Mouse 3W佐剂混合后注射免疫Balb/c小鼠，取血清检测血清效价，将脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行融合后培养，经克隆、冻存、纯化、透析、筛选后获得杂交瘤细胞株。

申请号为CN202010986023.X的专利文件公开了一种用于检测SARS-CoV-2病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用，其虽然也是采用重组N蛋白通过动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞培养筛选得到杂交瘤细胞，但其采用的重组N蛋白是通过新冠病毒基因组序列中编码N蛋白的核苷酸序列合成完整的开放读码框区域，并克隆到质粒载体pUC57上，设计上游引物和下游引物，并引入EcoRI/XhoI双酶切位点，经细胞转染和培养，纯化后得到带有组氨酸标签的重组N蛋白。

单克隆抗体是由单个B淋巴细胞产生的针对单个抗原决定族的单一抗体，因来自于一个B淋巴细胞，具有高度特异性而得到广泛应用。多由具有产生抗体功能的B淋巴细胞与具有永生功能的骨髓瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞分泌产生。因此不同的杂交瘤细胞株因其B淋巴细胞来源不同，所分泌的单克隆抗体多只有单一的反应性，即只能用于一种检测方法，筛选出分泌具有多反应性单克隆抗体的杂交瘤细胞株是一项巨大挑战。同时杂交瘤细胞株在传代过程中以及冻存与复苏过程中，常常导致分泌单克隆抗体能力的下降甚至丢失，获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株也是一项挑战。

发明内容

本发明为解决上述问题，提供了一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用。

具体是通过以下技术方案来实现的：

一、一种分泌抗新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤 细胞株，命名为nCoVN3G6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为： 中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月01日，保藏编号为CCTCC NO:C2020255。

二、所述分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株建立方法，包括以下步骤：