[发明专利]一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用

权利要求书

1.稳定分泌抗新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为nCoVN3G6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月01日，保藏编号为CCTCC NO:C2020255。

2.如权利要求1所述的稳定分泌抗新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6，其特征在于，所述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体重链为IgG2a，轻链为κ链。

3.如权利要求1或2所述的分泌抗新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6，其特征在于，所述杂交瘤细胞株是通过在大肠杆菌中表达重组SARS-COV-2病毒N蛋白、纯化、动物免疫、细胞融合、筛选、鉴定过程获得。

4.一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)重组核蛋白：在大肠杆菌中表达重组SARS-CoV-2病毒N蛋白，采用Ni2+亲和层析柱进行纯化；

(2)细胞融合：将纯化的重组核蛋白对小鼠进行免疫，将免疫鼠脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，培养得到杂交瘤细胞；

(3)筛选：采用间接ELISA和间接免疫荧光法检测杂交瘤细胞上清液，筛选出分泌抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6；

(4)鉴定：采用间接免疫荧光法特异性鉴定杂交瘤细胞株nCoVN3G6分泌的单克隆抗体与SARS-COV-2感染细胞、流感病毒感染细胞、EV71病毒感染细胞和柯萨基病毒感染细胞之间的反应。

5.如权利要求4所述的杂交瘤细胞株nCoVN3G6的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)重组核蛋白：根据公布的SARS-CoV-2基因组序列，人工合成编码SARS-CoV-2核衣壳蛋白的适于在大肠杆菌中表达的基因序列，并克隆到表达载体pET28a上，以重组表达载体转化感受态大肠杆菌BL-21进行培养，提取质粒进行基因测序，将测序正确的重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL-21，再进行培养至菌液A600值约为0.6时，加入终浓度为0.5M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG，培养诱导4h后收集菌体，经超声破碎、离心后取上清，用用Ni2+亲和层析柱进行纯化，并对纯化表达产物进行鉴定分析；

(2)细胞融合：用纯化后的重组核蛋白按每只每次小鼠100微克的剂量免疫BALB/C小鼠，经三次免疫和一次加强免疫后取免疫鼠脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，培养得到杂交瘤细胞；

(3)筛选：采用间接ELISA和间接免疫荧光法筛选阳性杂交瘤细胞，经3次有限稀释法亚克隆后，获得1株稳定分泌抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6；

(4)鉴定：采用间接免疫荧光法特异性鉴定杂交瘤细胞株nCoVN3G6分泌的单克隆抗体与SARS-COV-2感染细胞、流感病毒感染细胞、EV71病毒感染细胞和柯萨基病毒感染细胞之间的反应；并采用分泌抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔制备腹水，对腹水的ELISA及免疫荧光效价、单克隆抗体的特异性及所分泌单克隆抗体的亚类进行鉴定。

6.如权利要求1-3任一项所述的杂交瘤细胞株nCoVN3G6或权利要求4-6任一项所述建立方法获得的杂交瘤细胞株nCoVN3G6在新型冠状病毒检测中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是：杂交瘤细胞株nCoVN3G6在使用nCoVN3G6单抗的捕获法，获得检测新型冠状病毒IgM抗体检测ELISA试剂盒中的应用。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是：杂交瘤细胞株nCoVN3G6在使用nCoVN3G6单抗的双抗体夹心法，获得检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原ELISA试剂盒中的应用。