[发明专利]一种检测志贺氏菌的CDA引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测志贺氏菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对志贺氏菌的保守区片段扩增的引物组，为引物对Shi‑F2/Shi‑R2和/或引物对Shi‑MF/Shi‑MR；其中，Shi‑F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Shi‑R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；Shi‑MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Shi‑MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对志贺氏菌的快速准确检测，因此，适用于专业程度不高的机场、海关、口岸、社区等地的现场快速检测。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，可实现对志贺氏菌快速准确的检测。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测志贺氏菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

志贺氏菌(Shigella)是革兰氏阴性细菌，1898年由日本细菌学家志贺洁首先发现。人对志贺氏(杆)菌的易感性很高，是它的唯一宿主，主要通过摄取(粪便-口的污染)食物感染，最常见的症状是腹泻(水腹泻)、发烧、恶心、呕吐、胃抽筋、肠胃气胀和便秘。根据不同的人群和年龄，通常情况下只需摄入100个左右的病原菌即可导致感染发病。志贺菌属是人类细菌性痢疾最常见的病原菌，统称痢疾杆菌。根据生化反应与血清学试验该属细菌分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内志贺菌四群。我国以福氏和宋内志贺菌引起的菌痢最为常见。细菌性痢疾作为一种常见病，主要流行于发展中国家，全世界年病例数超过2亿，其中500万例需住院治疗，年死亡病例达65万。

志贺氏菌的常规生化鉴定方法检测须经过增殖培养、分离纯化、生化试验、血清学试验等，检测步骤繁琐、耗时长、准确性低，且一次检测完成样品项数较少。根据《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》(GB4789.5-2012)，我国现行标准采用的常规生化鉴定方法对志贺氏菌进行检测，整个过程需要4-5天，不能满足市场快速准确检验的需求，因此，面向现场的快速、灵敏、高特异性核酸标志物检测技术研发将为Shigella的防控提供强有力的保障。但应用RT-PCR方法，需要在标准生化分析实验室中使用精密的实时荧光PCR仪，并需要试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区，不适合用于现场快速筛查。因此，面向现场的快速、灵敏、高特异性核酸标志物检测技术研发将为志贺氏菌防控提供强有力的保障。

基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediatedIsothermal Amplification ofnucleic acids，CDA)是中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院开发的替代日本LAMP核酸扩增的方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成，适合基层医疗机构及地方检验检疫部门的应用。并且，CDA还可以大大缩短操作时间，减少样品污染机会，适合应用于志贺氏菌的快速诊断。此外，CDA所用关键成环引物约为30bp，较LAMP中成环引物40bp短，这将极大节省成本。

发明内容

本发明的目的是，提供一种检测志贺氏菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种非疾病诊断目的的检测志贺氏菌的CDA引物组，所述CDA引物组为以下引物对中的其中一对引物或两对引物，

引物对Shi-F2/Shi-R2，其中，Shi-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Shi-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对Shi-MF/Shi-MR，其中，Shi-MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Shi-MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。