[发明专利]一种三联体融合蛋白及其在病毒自剪切蛋白酶抑制剂活性评估和筛选时的应用

说明书

本发明公开了一种三联体融合蛋白及其在病毒自剪切蛋白酶抑制剂活性评估和筛选时的应用，三联体融合蛋白是将病毒自剪切蛋白酶的氨基端和羧基端分别用病毒自剪切蛋白酶识别序列与发光共振能量转移技术或荧光共振能量转移技术的一个发光蛋白和一个荧光蛋白或两个荧光蛋白连接构建而成；自剪切蛋白酶抑制剂可以抑制剂三联体融合蛋白的自剪切，从而维持它的发光共振能量转移信号或荧光共振能量转移信号。通过检测发光共振能量转移信号或荧光共振能量转移信号可以评估病毒自剪切蛋白酶抑制剂的活性。该方法安全、操作简便、灵敏度高、通量大，可广泛用于病毒自剪切蛋白酶抑制剂的基于细胞的筛选和活性评估。

技术领域

本发明属于医学病毒学技术领域。更具体的，涉及一种三联体融合蛋白及其在病毒自剪切蛋白酶抑制剂活性评估和筛选时的应用。

背景技术

许多病毒侵入细胞后会表达出一个或多个长蛋白链，长蛋白链上包含病毒复制或结构组成所必须的多个蛋白，它们串联在一起，这些蛋白需要通过自身的蛋白酶将它们从长蛋白链中剪切释放出来才能行使功能，病毒的蛋白酶通常也存在于这个长蛋白链中，需要首先利用自身活性将自己从长蛋白链中自剪切下来才能发挥活性，去切割长蛋白链中的其他酶切序列，使病毒的蛋白行使正常功能，抑制了这类病毒蛋白酶的活性就可以抑制病毒在细胞内的复制，因此病毒自身的自剪切蛋白酶是抑制这些病毒在细胞内复制的重要药物靶点。上述依赖自剪切蛋白酶才能正常复制的病毒包括但不限于所有冠状病毒3CL蛋白酶、人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶PR、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶NS3等。

近20年我们已经见证了三次大规模的冠状病毒流行，它们分别是SARS-CoV，MERS-CoV以及目前仍然在全球肆虐的SARS-CoV-2。目前在全世界每年有几百万的新增HIV感染病例。全球每年新增HCV感染也有几百万。临床上亟需更好的抗病毒小分子药物。

针对上述病毒蛋白酶的药物开发策略主要有筛选和基于结构的设计，目前无论哪种方法都依赖于首先用纯化蛋白对抑制剂进行体外活性评估，然后再通过细胞的抗病毒实验评估抑制剂的细胞活性。许多体外活性良好的抑制剂因为其细胞膜通透性或者特异性不好，在细胞内没有活性或活性很弱。另外，大多数高传染性病毒的细胞抗病毒实验需要在生物安全等级3或者4的实验室进行，然而这种实验室的资源相当短缺。以上原因限制了针对上述病毒蛋白酶的药物的开发速度。因此需要一种基于细胞的蛋白酶酶活报告系统来弥补这一不足。

目前报道的一些基于细胞的蛋白酶抑制剂筛选方法，都是在细胞中表达成熟的病毒蛋白酶，而自然状态下的自剪切蛋白酶需要在病毒长蛋白链中释放后才能达到其最大的活性，因此自剪切蛋白酶的成熟是一个指数过程，所以直接在细胞中表达成熟的病毒蛋白酶并不能模拟真实的病毒自剪切蛋白酶的成熟过程。另外，目前报道的一些基于细胞的蛋白酶抑制剂筛选方法都需要在细胞中同时表达病毒蛋白酶和感受器蛋白两个蛋白，需要精细控制二者的相对表达量，操作复杂。

因此，提供一种不依赖真病毒的、可以模拟自剪切蛋白酶的成熟过程、并且可以方便的检测的病毒自剪切蛋白酶活性的筛选方法，对于筛选评估病毒自剪切蛋白酶抑制剂以及开发针对这些病毒的药物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷和不足，提供一种可模拟病毒自剪切酶成熟过程的三联体融合蛋白及其在筛选和活性评估病毒自剪切蛋白酶抑制剂中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种三联体融合蛋白，所述三联体融合蛋白包括病毒自剪切蛋白酶和生物发光共振能量转移技术的一个发光蛋白和一个荧光蛋白或荧光共振能量转移技术的两个荧光蛋白，其中，所述一个发光蛋白和一个荧光蛋白或两个荧光蛋白通过病毒自剪切蛋白酶的酶切识别序列连接在病毒自剪切蛋白酶的氨基端和羧基端。所述病毒自剪切蛋白酶为可以切割自身一端或两端氨基酸序列的、位于病毒长蛋白链上的蛋白酶。