[发明专利]基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法

说明书

本发明属于分析化学及临床检验领域，公开了一种基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法。包括制备Wulff型石墨相氮化碳、构建外泌体捕获分析一体化分析方法、外泌体的表型分析，实现基于单一材料的捕获/分析双单元同时启动的外泌体高效捕获与原位分析一体化分析，捕获效率上赶超现有的各种外泌体分离技术，对外泌体的原位分析具有良好的灵敏度，并且做到了捕获与分析机制的有效整合，将整个分析过程(包括捕获和分析)控制在37min之内，极大提高了外泌体表型分析的效率和准确率。

技术领域

本发明属于分析化学及临床检验领域，具体涉及一种基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法。

背景技术

癌症一直以来都是人类社会致死率最高的疾病之一，尽管近几十年来相关诊疗技术不断发展，依然难以彻底治愈。近年，为提升癌症患者的生存率，人们提出了精准医学的概念。即依据患者内在生物学信息以及临床症状和体征，对患者实施分类分型并给出针对性临床诊疗方案的治疗策略。目前我国已陆续开展临床用基因组学、蛋白组学、精准医学大数据资源整合等多方面的研究。但由于疾病基因学的复杂性决定了单一的组学研究很难系统且完全地解释疾病的整体生物学行为，从而影响精准的疾病细分。因此，开发和完善新的组学信息分析方法，构建相应的疾病知识网络，对提高癌症先期诊断和分类分型的准确率至关重要。

外泌体因其分布广泛，且携有母源细胞丰富的生理信息，尤其是其表面蛋白的分化和表达能够与其母源细胞在疾病形成过程中发生的显著变化保持一致，是目前大受欢迎的非侵入性癌症诊断、预后的生物标志物，并已被应用于乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌的先期诊断中。因此，对外泌体的表型分析和数据整合有望构建疾病知识网络模型，进而探索组学数据整合的开发，为癌症的先期诊断及分类分型提供理论基础。

目前，对外泌体进行表型分析的流程主要分为捕获分离和分析检测两部分。高效和高选择性的外泌体分离技术是开展外泌体分析检测研究的前提。常见的外泌体分离技术基于其物理化学和生物化学性质差异建立，主要有超速离心、尺寸分离、免疫亲和捕获、微流控分离等。其中超速离心是目前使用最广的分离方法，但无法用于微量样品中外泌体的分离；微流控技术能够解决上述问题，但在制作工艺和成本等方面要求较高；其余如尺寸排阻、免疫磁珠等方法会存在耗时耗力等问题，这使得对外泌体的表型分析在实验初期就面临各种困难。因此，开发样品用量小、操作简便、分离效率高的外泌体分离方法十分必要。对于外泌体的分析检测，目前常用的方法包括表面增强拉曼、荧光法、比色法、电化学法等。但这些方法通常涉及复杂的化学反应机制和复杂的定量过程，仍有很大的空间需要改进。此外，在这类分步操作进行外泌体表型分析的过程中，不仅费时费力，而且过长的周期和过多的操作可能会影响外泌体的生物活性，进而影响分析结果的准确性，无法推广到临床检测上。因此，亟需开发外泌体捕获分析一体化的分析方法，以有效解决上述困难，进而实现对外泌体表型信息的高效分析与整合。

发明内容

为了克服现有技术进行外泌体表型分析过程费时费力、影响外泌体生物活性从而进一步影响分析结果的准确性的不足，本发明提供一种基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，通过将硼酸亲和技术与基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析结合极大提高了外泌体表型分析的效率和准确率。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其步骤为：

1.制备Wulff型石墨相氮化碳：将加入了尿素的氧化铝坩埚置于管式炉中，加热升温至600℃并保持4h后自然冷却至室温，得到的黄色粉末即为原始石墨相氮化碳；随后通过HBTU/DIEA酰胺反应将间-羧基苯硼酸修饰到上步制备出的原始石墨相氮化碳上得到Wulff型石墨相氮化碳，60℃下烘干，随后将Wulff型石墨相氮化碳置于去离子水中，液体辅助超声并离心，收集上清液即得Wulff型石墨相氮化碳分散液。