[发明专利]基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法

权利要求书

1.基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其特征在于，步骤为：

1).制备Wulff型石墨相氮化碳：将加入了尿素的氧化铝坩埚置于管式炉中，加热升温至600℃并保持4h后自然冷却至室温，得到的黄色粉末即为原始石墨相氮化碳；随后通过HBTU/DIEA酰胺反应将间-羧基苯硼酸修饰到上步制备出的原始石墨相氮化碳上得到Wulff型石墨相氮化碳，60℃下烘干，随后将Wulff型石墨相氮化碳置于去离子水中，液体辅助超声并离心，收集上清液即得Wulff型石墨相氮化碳分散液；

2).构建外泌体捕获分析一体化方法：将表面常见跨膜蛋白CD63用PBS缓冲液稀释至10-50μg mL^-1，取20-100μL上述浓度CD63抗体与100μL所述步骤1中的Wulff型石墨相氮化碳分散液混合，在37℃条件下孵育20-45min后离心以除去未标记上的抗体，并将沉淀重新分散于120-200μLPBS中，即得到CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳；

取120-200μL上述CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳，并与MCF-7细胞来源的外泌体混合孵育30-60min，随后离心并将下层沉淀重悬于120-200μLPBS中，最后测试体系在320nm激发下的荧光光谱，记录其在440nm左右的荧光强度，带入标准曲线算出样本中目标外泌体的浓度；

3).外泌体的表型分析：通过前期构建的外泌体捕获分析一体化方法，将不同外泌体表面膜蛋白对应的抗体标记到Wulff型石墨相氮化碳上，依次对不同细胞来源的不同外泌体表面膜蛋白进行分析鉴定，对外泌体表面不同靶蛋白产生的荧光信号进行箱线图制作和分析，并采用双边student t-test进行显著性分析。

2.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其特征在于，所述步骤1中将间-羧基苯硼酸修饰到原始石墨相氮化碳上的具体步骤为：将间-羧基苯硼酸和HBTU依次加入无水DMF中，在50-80℃下连续搅拌30min后，加入DIEA和原始石墨相氮化碳固体粉末，继续搅拌24h；反应结束后，离心并依次用稀盐酸、无水乙醇和去离子水清洗2-3次，所得固体粉末即Wulff型石墨相氮化碳。

3.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其特征在于，所述步骤1中制备Wulff型石墨相氮化碳分散液过程中使用液体辅助超声10h，并于转速5000rpm下离心10min。

4.根据权利要求2所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其特征在于，所述具体步骤中间-羧基苯硼酸、HBTU和DIEA的比例为1:1.2:1.2。

5.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其特征在于，所述步骤2中使用的PBS缓冲液pH为7.4，含质量分数为2％的BSA。

6.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其特征在于，所述步骤1制备及步骤2中使用的Wulff型石墨相氮化碳分散液浓度为0.5mgmL^-1。

7.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其特征在于，所述步骤2中离心过程转速为12000rpm。

8.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其特征在于，所述步骤3中外泌体表面膜蛋白具体为CD63、EpCAM和HER2。

9.根据权利要求7所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法，其特征在于，所述外泌体表面膜蛋白来源细胞为HeLa、HepG2、MCF-7和MCF-10A。