[发明专利]一种基于Nanopore宏基因组测序检测环境样品中新抗性基因的方法

说明书

本发明提供一种基于Nanopore宏基因组测序检测环境样品中新抗性基因的方法，该方法包括以下步骤：1)从样品中提取总DNA，并进行DNA纯化；2)对纯化后的DNA进行宏基因组测序；3)对宏基因组测序后的数据进行分析。本发明通过提取、纯化、提纯等步骤获得满足三代Nanopore测序要求的DNA；通过序列组装以及纠错、校正，获得高质量的长序列，增加序列比对的准确性和可靠性；通过对抗生素抗性基因数据库进行扩展，使得检测结果更加准确、全面。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域和宏基因组测序领域，尤其是涉及一种基于Nanopore宏基因组测序检测环境样品中新抗性基因的方法。

背景技术

目前，检测环境样品中抗生素抗性基因的方法包括细菌纯培养法、qPCR法、基因芯片法和宏基因组法。细菌纯培养法是一种相对传统的方法，通过细菌的培养、分离，利用药敏实验和全基因组测序对细菌携带的抗性基因进行检测，但是该法可能会遗漏很多抗性基因，因为大部分细菌不具可培养性。qPCR法对关注的抗性基因设计引物，通过荧光定量实时PCR的方法可以对样品中抗性基因进行定量检测，但是只能针对已知抗性基因进行检测，不能发现新基因。基因芯片的方法则是利用荧光或者同位素标记的方法，通过基因芯片探针杂交的方法检测样品中的抗性基因，其与qPCR相似不能发现新的抗性基因。

氯霉素类抗生素是二氯乙酰胺衍生物，又称酰胺醇类抗生素，在化学结构上由二氯乙酰胺、丙二醇与苯基构成，其化学性质稳定，在水中溶解度较低，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，是广谱抑菌型抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制效果。该类抗生素的抑菌作用主要是通过与细菌的50S核糖体亚基结合来抑制肽酰基转移酶的活性，从而使蛋白质合成受阻。由于其使用量较大，在环境中检出频率很高，包括地表水、地下水、养殖废水、生活污水，甚至在一些饮用水水源地中也能检测到。氯霉素在环境中的富存，会导致耐药菌和耐药基因的产生和传播，最终会给人类的健康造成威胁。因此，对于环境样品中氯霉素新型抗性基因的准确检测具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够利用三代Nanopore宏基因组测序鉴定环境样品抗生素抗性基因的方法。

本发明一个方面提供了一种抗性基因的检测方法，所述方法包括以下步骤：

1)从样品中提取总DNA，并进行DNA纯化；

2)对纯化后的DNA进行宏基因组测序；

3)对宏基因组测序后的数据进行分析；

其中步骤2)包括：

2-1)建立文库：首先修复DNA缺口，使DNA链长度最大化；然后进行DNA末端修复和尾部加dA；随后连接接头，构建完成的文库；

2-2)进行宏基因组测序：采用测序芯片Flow cells R9.4和测序仪MinION对文库进行测序；

步骤3)包括：

3-1)对测序数据进行质控与组装，其中，所述质控为通过软件pycoQC评估数据质量，包括序列读长分布和质量分布，使用软件Nanofilt对fastq序列进行质控，质量阈值设置为Q10，长度设置大于1000；所述组装为使用软件Flye对质控后数据的进行组装，并使用mekada对组装后的序列纠错；

3-2)对抗生素抗性基因进行分析，其中，先对抗生素抗性基因数据库SARG进行扩展，将SEQ ID No.1所示的氯霉素抗性基因GMC补充到抗生素抗性基因数据库SARG中，重新格式化扩展后的数据库；然后使用blastp进行比对和注释。

在本发明的技术方案中，在步骤3-2)中，使用blastp比对ORF文件，所述ORF文件为通过prodigal预测步骤3-1)获得的组装序列的开放阅读框。