[发明专利]羰基还原酶突变体及其不对称合成双手性化合物的应用

说明书

本发明公开了一种羰基还原酶突变体及其不对称合成双手性化合物的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示野生型羰基还原酶KmCR‑WT氨基酸序列第100位进行单突变获得的。本发明突变体A100S活力较野生型提高了0.8倍，且具有严格的S‑构型立体选择性。对其他本发明所述的脂肪族酮化合物，催化活力均有提升，其中对异丁酰乙酸乙酯、丁酰乙酸乙酯的酶活高于目前报道的文献水平。

(一)技术领域

本发明涉及一种属于短链脱氢酶/还原酶超家族(SDR)的羰基还原酶KmCR的半理性改造策略，其突变体催化合成双手性二醇6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯，具体涉及利用计算机辅助选择合适的区域进行易错PCR，并建立合适的筛选方法。

(二)背景技术

羰基还原酶(Carbonyl reductase,EC 1.1.1.184)属于氧化还原酶大类，在自然界中非常常见，广泛存在于各种植物、微生物、哺乳动物组织中，依赖NADP(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)或NAD(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为辅酶。按照其氨基酸的序列长度和催化活性位点的差别，羰基还原酶主要分布于三个超家族：醛酮还原酶超家族(Aldo-keto reductases，AKRs)、中链脱氢酶/还原酶超家族(Medium-chain dehydrogenases/reductases，MDRs)、短链脱氢酶/还原酶超家族(Short-chain dehydrogenases/reductases，SDRs)。

AKRs通常以单聚体形式存在，约含有320个左右的氨基酸，大小约为35kDa，是一类非金属依赖型还原酶。它不需要Rossmann折叠就能够与烟酰胺类辅酶结合。AKRs的序列相似度较高，且具有典型的(α/β)₈桶状结构，Y(酪氨酸)-K(赖氨酸)-H(组氨酸)-D(天冬氨酸)是其催化活性四联体。MDRs通常以二聚体或四聚体的形式存在，单亚基大约为350个氨基酸，是一类锌-或非锌-依赖型脱氢酶，取决于是否具有保守的G-H-E Zn²⁺结合位点。它们的序列同源性较高，一般可达到40～90％。其三维结构含有Rossmann折叠，TGxxxGxG是其保守辅酶结合域，D(天冬氨酸)-Y(酪氨酸)-K(赖氨酸)-H(组氨酸)是其催化活性四联体。

SDRs是迄今为止已知的最大、最古老的蛋白质超家族之一，它的来源非常丰富，广泛分布于各种生物体中，从古细菌到高等的真核生物和病毒。SDRs通常为单聚体、二聚体或四聚体蛋白，单亚基约含有250个氨基酸残基，但也有350个残基的SDR形式，这些亚基在C端延伸。SDRs是一类非金属依赖型脱氢酶。尽管大部分短链脱氢酶的序列同源性较低，一般只有15～30％，但是它们的三级结构具有一些共同的特性：(i)具有保守的3D结构Rossmann折叠，通常为β折叠与α螺旋形成的β-α-β-α-β拓扑结构；(ii)N端具有核苷酸辅因子结合基序TGxxxGxG；(iii)具有YxxxK活性位点载体。SDR经典的催化三联体被定义为“S-Y-K”，但是这并不是绝对的。其中，Ser有时候被Thr取代，Tyr有时候被Met取代。随着结晶技术的发展，越来越多短链脱氢酶的结构被鉴定，Asn被发现对短链脱氢酶催化三联体中的Lys有一定的激活作用，由此形成了大多数SDR形式的催化活性中心“N-S-Y-K”。

羰基还原酶能够催化脂肪酮、芳香酮、醛和醌等不对称还原生成相应的手性醇。而手性醇在医药制造、食品健康、农用化学品等领域扮演着非常重要的角色。在本发明中，我们设计一种区域epPCR(error-prone PCR)的定向进化策略，并通过薄层色谱的筛选方法获得较野生型菌株羰基还原酶KmCR具有更高活力和立体选择性的突变体。

(三)发明内容