[发明专利]一种检测乳清蛋白浓缩物对骨质疏松影响的方法

权利要求书

1.斑马鱼在制备用于检测乳清蛋白浓缩物对骨质疏松影响的动物模型中的应用。

2.一种检测乳清蛋白浓缩物对骨质疏松影响的方法，其特征在于，包括：以斑马鱼作为实验动物构建骨质疏松斑马鱼模型，以乳清蛋白浓缩物处理所述骨质疏松斑马鱼模型，分析骨质疏松缓解效果。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述骨质疏松斑马鱼模型的构建包括：采用泼尼松龙处理斑马鱼，所述泼尼松龙的处理浓度为22-28μmol/L。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述乳清蛋白浓缩物的处理剂量为0.1-1μg/5条斑马鱼/24h；

优选地，所述乳清蛋白浓缩物的处理浓度为0.1-1μg/mL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述乳清蛋白浓缩物的处理时间为从斑马鱼的2-4dpf至8-9dpf；

优选地，所述斑马鱼培养在多孔培养板中，每孔4-6条。

6.根据权利要求2～5任一项所述的方法，其特征在于，在乳清蛋白浓缩物处理结束后，将乳清蛋白浓缩物处理后的斑马鱼处死，采用茜素红染色，分析斑马鱼头骨染色面积和累积光密度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述茜素红染色包括：将斑马鱼经3.5-4.5％的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定2-4h，置于45-55％的乙醇中处理5-15min，去除乙醇后，加入茜素红染色10-14h，去除染色液，经水洗涤后采用漂白剂漂白1.5-2.5h，去除漂白剂后，先后采用体积比为3:1的0.5％氢氧化钾溶液和甘油、体积比为1:1的0.5％氢氧化钾溶液和甘油，体积比为1:3的0.5％氢氧化钾溶液和甘油分别处理5-7h，最后保存于甘油中，以甘油作为斑马鱼的固定剂进行显微镜观察和拍照；

优选地，所述漂白剂含有1-2％的双氧水和0.8-1.2的氢氧化钾溶液。

8.根据权利要求2～7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测乳清蛋白浓缩物对小鼠胚胎成骨细胞增殖与分化的影响，

所述增殖的影响的检测为采用MTT法进行，

所述分化的影响的检测为通过对小鼠胚胎成骨细胞的碱性磷酸酶ALP的活性进行检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述MTT法包括如下步骤：

(1)将小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1以2×10³-4×10³/100μL的密度接种于培养板；

(2)加入不同浓度的乳清蛋白浓缩物，孵育20-26h后，弃去旧培养基，加入90-110μL的10％、5mg/mL的MTT工作液，继续培养3.5-4.5h；

(3)弃去旧培养基，每孔加入90-110μL DMSO，80-120rpm摇晃8-12min，检测得到的反应体系在490nm下的吸光度。

10.乳清蛋白浓缩物的如下任一种应用：

(1)在制备用于防治骨质疏松的药物、食品、保健品、饲料中的应用；

(2)在制备用于增强成骨细胞增殖和/或分化的药物、食品、保健品、饲料中的应用；

(3)在制备用于增加骨密度的药物、食品、保健品、饲料中的应用；

(4)在制备用于促进骨骼生长、发育、愈合、矿化的药物、食品、保健品、饲料中的应用。