[发明专利]基于等温扩增的新型冠状病毒的快速检测方法

说明书

本发明涉及分子生物学检测和传染病检测控制技术领域，提供了一种基于等温扩增的新型冠状病毒的快速检测方法。所述的基于等温扩增的新型冠状病毒的快速检测方法可以在10分钟内快速进行新冠病毒检测，比现有的qPCR方法和Cas9方法可节省30‑40分钟时间；所述的基于等温扩增的新型冠状病毒的快速检测方法可以检测低至1‑10拷贝数的目的基因片段；所述的基于等温扩增的新型冠状病毒的快速检测方法与荧光定量PCR方法检测的病毒核酸样本结果完全一致，且对其他冠状病毒无交叉反应。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测和传染病检测控制技术领域，尤其涉及基于等温扩增的新型冠状病毒的快速检测方法。

背景技术

目前对新冠病毒进行检测的金标准是基于聚合酶链式反应PCR的实时荧光定量方法，需要在循环之间进行温度的转换，而且由于扩增效率较低，导致耗时长，很难检测到低拷贝数的病毒核酸，导致ct值偏大，易于在病原微生物医学检验出现假阴性结果，灵敏度低。

近年来发展起来的基于Cas9/Cas12和srRNA的等温扩增方法，需要先扩增后激活Cas9，然后对现有探针进行切割再行检测，步骤繁琐，组分复杂，需要配制包括重组酶Cas9酶等多种组分，成本非常高，限制了其应用领域和范围。

为此，设计基于等温扩增的新型冠状病毒的快速检测方法，解决以上问题。

发明内容

本发明为克服以上不足，提供基于等温扩增的新型冠状病毒的快速检测方法，该检测方法包括以下步骤：

第一步：使用生物信息学技术设计引物和探针；

其中，设定扩增片段400bp～450bp，引物探针GC含量在40％～60％之间，并且引物探针内部及引物探针之间不产生二聚化；

第二步：使用不同的引物配对对目的序列进行扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶显色筛选出扩增效率最高的引物组合；

第三步：对探针内部添加THF，并对其上游的胸腺嘧啶进行荧光修饰，下游添加淬灭基团，获得荧光探针，随后使用扩增序列内部的不同探针进行等温扩增并检测荧光信号，从而确定最佳的引物和探针组合；

第四步：对探针内部添加THF，并对其5’端碱基进行荧光修饰，同时下游引物进行生物素修饰，获得适用于层析试纸条的引物探针；

第五步：向反应体系中各加入2μl上游引物，下游引物和探针(10μM)，同时在每50μl体系中加入1U纯化RecA重组酶以及1U纯化单链DNA结合蛋白，并向体系中补充适量浓度聚乙二醇及氯化钾氯化镁和DNTP；

第六步：在42℃水浴锅或实时荧光定量PCR中进行反应，PCR仪器设置为42℃、2min，42℃40Sec/Cycle，40Cycle，检测FAM通道和HEX通道荧光。

进一步，优选的，能够检测新冠病毒核酸样本的探针组合序列如下：

N256For：ACTACCGAAGAGCTACCAGACGAAT

N689Rev：GCCTTTACCAGACATTTTGCTCTCA

Probe N645 exo：GGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCA

S2531For：TGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCAC

S2850Rev：AAAGCTTGTGCATTTTGGTTGACCAC

Probe S2560exo：AACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGTCACAGATGAAATGA

本发明的有益效果是：