[发明专利]一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法

说明书

本发明公开了一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法，包括以下步骤：A、鲜烟叶中次生代谢物的微波辅助提取；B、对提取物进行超高效液相色谱‑紫外检测器‑串联四级杆‑飞行时间质谱的分析；C、对次生代谢物进行鉴定，并对鉴定的13种黄酮、19种苯丙烷、4种香豆素及6种酚酰胺类进行相对定量分析。本发明建立的一种微波辅助提取‑超高效液相色谱‑紫外检测器‑串联四级杆‑飞行时间质谱同时测定鲜烟叶中的13种黄酮、19种苯丙烷、4种香豆素及6种酚酰胺类的方法，具有定性定量代谢物种类多且全面的特点，能快速、高灵敏度且稳定性好的高通量分析鲜烟叶中的黄酮、苯丙烷、香豆素、酚酰胺类次生代谢物。

技术领域

本发明涉及一种简单、稳定、准确的同时分析鲜烟叶中黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类等次生代谢物的方法，属于烟草化学成分的测定方法技术领域。

背景技术

烟草中的黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类都是重要的次生代谢物，次生代谢物主要是指在1000以下的小分子代谢物，它们与植物的抗性、信号传导、生长发育、植物的花色、香气等现象密切相关，因此，对黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类的组成及含量进行研究具有重大植物生理学意义，而且还能为基因组、转录组等的功能验证提供化学物质支撑。

烟草黄酮类化合物是烟草中含量较丰富的一类物质，在烟草的生长发育、烟叶外观色泽、调制特性、香吃味及烟气生理强度等方面均起着重要作用，是衡量烟草品质的一个重要因素。烟草黄酮的含量和氧化程度不仅影响到烟叶的外观质量，也影响烟叶的内在质量。苯丙烷类是苯丙烷代谢途径的中间产物，也是木质素合成途径代谢产物，它与对逆境的抗性以及烟草的特色形成等生理活动有着密切的关系。香豆素是一类自然界中广泛存在的生物活性物质。由于植物香豆素成分结构类型多，立体化学复杂，具有多种生物活性，在烟草的抗逆与抗病中有重要作用。植物酚酰胺有助于植物发展和抵抗环境应激源，并有一定的抗植物病原体的作用，同时与植物的成花和生殖分化也有密切相关。

由于黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类具有极性强，挥发性差及紫外吸收强的特性，常利用液相色谱进行分离与紫外检测器进行定性及定量，但常常只关注其中1类或2类次生代谢物进行分析，如李力等发明了同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，赖燕华等发明了同时测定烟草中14种多酚类化合物的HPLC-DAD分段检测方法，刘萍萍等发明了一种烟叶中多酚类化合物(10种)的检测方法，孔光辉等发明了一种超高效液相色谱-串联质谱法定量分析烟叶中的18种多酚，金立锋等发明了一种检测鲜烟叶中多种类黄酮(7种)代谢组学方法，李勇等发明了一种定量分析烟叶中12种类黄酮物质的检测方法等，目前还未见报道全面的对烟草中黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类这4类次生代谢物同时进行筛查与定量分析。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种能够同时分析鲜烟叶中黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类的色谱检测方法，该方法具有简单、快速、高灵敏度且稳定性好等优点，可以提高样品检测通量与数据准确性；另外，4类物质的同时分析，也大大降低了分析工作量，可以有效的克服现有技术的不足。

本发明的技术方案是：一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法，包括以下步骤：

A、鲜烟叶中黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的提取：称取冷冻干燥鲜烟叶粉末于微波提取罐中，加入内标，再加入提取液进行微波辅助提取，取提取物于离心管中离心，取上层清液过有机滤膜后得滤液；

B、鲜烟叶中黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析：采用超高效液相色谱-紫外检测器-串联四级杆-飞行时间质谱进行色谱分析；

C、鲜烟叶中黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的定性与定量分析：定性采用高分辨质谱图比对的方法，定量采用内标法。

优选的，所述步骤A中提取液为0.1％甲酸的甲醇水溶液(v/v 7:3)。

优选的，所述步骤A中微波辅助提取的条件为800w，90℃提取5min。