[发明专利]一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法

权利要求书

1.一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、鲜烟叶中黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的提取：称取冷冻干燥鲜烟叶粉末于微波提取罐中，加入内标，再加入提取液进行微波辅助提取，取提取物于离心管中离心，取上层清液过有机滤膜后得滤液；

B、鲜烟叶中黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析：采用超高效液相色谱-紫外检测器-串联四级杆-飞行时间质谱进行色谱分析；

C、鲜烟叶中黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的定性与定量分析：定性采用高分辨质谱图比对的方法，定量采用内标法。

2.根据权利要求1所述的一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法，其特征在于：所述步骤A中提取液为0.1％甲酸的甲醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法，其特征在于：所述步骤A中微波辅助提取的条件为800w，90℃提取5min。

4.根据权利要求1所述的一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法，其特征在于：所述步骤A中内标为1.88mg/mL肉桂酸和14.796mg/mL己二酸。

5.根据权利要求1所述的一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法，其特征在于：所述步骤B中色谱分析条件为Acquity UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm,)，柱温35℃，进样量为0.5μL；流动相A为超纯水(含0.05％HCOOH)，B为质谱级乙腈，流速为0.35mL/min，梯度洗脱如下：初始98％A保持1min，16min变为60％A，20min变为5％A，保持到24min，25min变为0％A，保持到27min，29min变为98％A，保持到31min结束；质谱条件采用一级质谱ESI负模式，氮气为雾化气和锥孔气，雾化气与锥孔气流速为800L/h和50L/h，雾化气温度450℃，源温度120℃，毛细管电压：2.0KV，锥孔电压：35V，碰撞能力6eV，扫描时间为0.2s，间隔为0.02s，扫描范围70-1000，检测器电压为1950V；利用亮氨酸脑咖肽为实时校准液，浓度为200ng/mL，流速为10μL/min，校正间隔为15s，且校正结果为3次平均；MS^e数据采集能量为6-35eV以获得相应的碎片质谱图。

6.根据权利要求1所述的一种鲜烟叶中同时分析黄酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺类次生代谢物的色谱分析方法，其特征在于：所述步骤C中定性采用高分辨准分子离子、碎片离子、紫外吸收结合数据库Scripps、HMDB、Respect及Massbank对主要的代谢物组成进行鉴定，同时利用黄酮中不同糖苷键位置具有不同的MS^e碎裂规律，以确定黄酮的准确结构；定量采用内标法相对定量方法。