[发明专利]猪流行性腹泻病毒（PEDV）ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统及应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，涉及猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统及应用，本发明以临床分离的PEDV GII型毒株HN20的全基因组序列为基础，将PEDV全基因组序列分为A、B、C、D和E共5个片段，分别插入载体pSMART中，同时将A片段中的SapI内切酶酶切位点和E片段中的BsmBI内切酶酶切位点进行同义突变作为分子标记并删除E片段中的ORF3和E基因编码框。将构建的5个重组质粒分别进行酶切，胶回收，体外连接转录后，将转录的RNA电转进诱导表达PEDV ORF3和E蛋白的BHK‑21细胞中，拯救出单轮感染的PEDV病毒。本发明的PEDV ORF3和E蛋白的反式互补单轮感染系统有助于PEDV的抗病毒药物、致病机制以及新型疫苗的研制。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统及应用

背景技术

据报道，猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)能够感染所有年龄段的猪群，主要引起急性腹泻、呕吐、脱水等症状，病理变化可见肠绒毛萎缩、脱落、出血和肠壁变薄等。PEDV是单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目、冠状病毒科、α冠状病毒属，基因组全长约28kb,基因组含有5‘帽子结构和3’polyA结构，此外还具有6个开放阅读框，分别为非结构蛋白基因ORF1a/1b，四个结构蛋白基因(S、M、E和N)和附属蛋白基因ORF3。其中ORF1a/1b能够编码两个多聚蛋白pp1a和pp1b，这两个多聚蛋白进一步被加工成16个非结构蛋白。该病最早发现于1971年，随后在欧洲和亚洲均有报道，目前该病在全球范围内流行，给养猪业造成了巨大的损失，是严重危害养猪业的主要传染病之一。

根据病毒基因组和S基因的遗传演化分析可将PEDV分为GI型和GII型，GI型主要包括CV777和DR13等经典毒株，GII型主要包括PC22A、Colorado/2013等毒株，目前在亚洲和美洲国家主要流行的是高毒力的GII型毒株，基于GI型毒株设计的疫苗并不能有效保护猪群免受GII型毒株的感染，二者没有交叉免疫保护能力，因此急需针对GII型毒株的有效疫苗。

反式互补是分子病毒学领域中的一项非常重要的技术，能研究病毒在感染周期内的进入、复制、转录、翻译和组装等不同步骤，可用于抗病毒药物筛选、候选疫苗的研制和病毒感染机制的研究。

PEDV HN20是本发明研究团队于2020年分离的一株PEDV强毒株，通过全基因组测序并与其它代表毒株进行全序列比对与遗传演化分析，表明PEDV HN20属于当前流行的GII型毒株。

现有技术中，由于不同冠状病毒间基因序列差异较大，尚未见有PEDV的反式互补ORF3和E蛋白的单轮感染系统，基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种PEDV的反式互补单轮感染系统，用于抗PEDV药物筛选和研制有效的针对PEDV的候选疫苗。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状，针对现存技术中的不足，提供一种PEDV的反式互补单轮感染系统，具体涉及PEDV HN20毒株的ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统，本发明通过将缺失ORF3和E基因的PEDV全基因组分为5个片段，体外连接转录后电转进反式互补ORF3和E基因的细胞，构建方法简单，可高效拯救出具有单轮感染能力的PEDV病毒。

本发明的猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统通过下述方法构建：

包括缺失PEDV HN20毒株ORF3和E基因的全长基因组的5个重组质粒，其中ORF3和E基因区可被替换为Turbo-GFP、zsGreen、EGFP、tREP和GLuc等报告基因，用于含有报告基因的ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统的构建；

包括在PEDV HN20毒株的ORF3和E基因区被替换插入嵌合表达PRRSV GP5、CSFVE2、TGEV Spike、PCV capsid结构基因等，用于含有外源基因的N蛋白反式互补单轮感染系统的构建；