[发明专利]猪流行性腹泻病毒（PEDV）ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统及应用

权利要求书

1.猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统，其特征在于，按下述方法构建：

(1)以PEDV HN20毒株的cDNA为模版，设计引物扩增PEDV-A片段、PEDV-B片段、PEDV-C片段、PEDV-D片段和PEDV-E片段；

(2)将步骤(1)中的扩增的片段通过同源重组方法克隆到pSMART载体中，得重组质粒pS-A、pS-B、pS-C、pS-D、pS-E；

(3)将重组质粒pS-A中的SapI限制性内切酶位点和重组质粒pS-E中的BsmBI限制性内切酶位点进行同义突变，并将重组质粒pS-E中的ORF3和E基因编码框删除，得重组质粒mpS-A和mpS-E；

(4)用SapI酶切重组质粒mpS-A，SapI和BglI酶切重组质粒pS-B，BglI和BsaI酶切重组质粒pS-C，用BsmBI酶切重组质粒pS-D和mpS-E，得PEDV HN20毒株全基因组中缺失ORF3和E基因编码框的5个片段；

(5)用T4DNA连接酶将A、B、C、D和E五个片段连接，得PEDV HN20毒株全基因组缺失ORF3和E基因的全长cDNA克隆；

(6)以PEDV HN20毒株的cDNA为模版，设计引物扩增PEDV HN20毒株的N基因的cDNA,在上下游引物出分别加入T7启动子序列和终止子序列，利于N基因的体外转录；

(7)以PEDV HN20毒株的cDNA为模版，分别设计引物扩增PEDV ORF3和E基因，通过同源重组方法克隆到Tet-ON诱导型的pCW57-Turbo-GFP载体中，ORF3和E之间通过IRES序列相连，串联表达PEDV ORF3和E基因，得重组质粒pCW57-PEDV-ORF3-E；

(8)将重组质粒pCW57-PEDV-ORF3-E和慢病毒包装质粒pMD2.G和pSPAX共转293T细胞进行慢病毒包装，将包装的慢病毒转导BHK-21和Vero细胞，经嘌呤霉素筛选，得到在Dox药物诱导情况下稳定表达PEDV ORF3和E基因的细胞系BHK-21-PEDV-ORF3-E和Vero-PEDV-ORF3-E。

2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统，其特征在于，所述的构建方法中：

(1)将所述的缺失PEDV ORF3和E基因编码框的全长基因组cDNA克隆采用体外转录获得缺失ORF3和E基因的全长病毒RNA；

(2)将获得的缺失ORF3和E基因的全长病毒RNA和N基因RNA转录本使用电转仪电转入稳定表达PEDV ORF3和E基因的BHK-21-PEDV-ORF3-E细胞系中，拯救得到具有单轮感染能力的PEDV病毒。

3.权利要求1的猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统在用于制备新型PEDV疫苗中的应用。

4.权利要求1的猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统在制备筛选抗PEDV药物制品中的应用。

5.权利要求1的猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3和E蛋白反式互补单轮感染系统统在制备PEDV致病机理和基因功能研究制品中的应用。