[发明专利]一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法

权利要求书

1.一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用氧化铝粉末打磨3mm直径的柱状金电极直至所述金电极表面滑成镜面，接着把打磨好的金电极用超纯水和无水乙醇超声清洗干净；然后，用新鲜配置的活化溶液活化金电极表面，超纯水清洗后用循环伏安法以-0.3V～1.5V的电压在0.5M的硫酸溶液中反复扫描，直到稳定重复的CV曲线出现，用超纯水清洗干净后烘干待用；

2)将所述步骤1)预处理后的所述金电极用循环伏安法在0.5mM HAuCl₄溶液中扫描50圈，用超纯水清洗干净后烘干待用；

3)在所述步骤2)的得到的修饰好纳米金的金电极上滴加10μM二茂铁修饰的捕获DNA，避光过夜孵育；

4)将所述步骤3)得到的金电极浸泡于1mM 6-巯基-1-乙醇与10mM Tris-HCl缓冲液中37℃反应2h，再用超纯水反复清洗去除未结合的6-巯基-1-乙醇，得到用6-巯基-1-乙醇封闭好的金电极；

5)向所述步骤4)得到的金电极滴加50μL含有不同浓度的mecA基因、5mL亚甲基蓝修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的聚合酶缓冲液，37℃混合孵育2h；

6)将所述步骤5)得到的电极作为工作电极，并采用Ag/AgCl作为参比电极、铂丝电极作为对电极，同时置于20mM Tris-HCl中，采用试差脉冲伏安法，的电压范围内进行检测，得到二茂铁和亚甲基蓝的特征响应电流值，亚甲基蓝的响应电流值与二茂铁的响应电流值比值的对数与mecA基因浓度的对数具有良好的线性关系，在相同的测试条件下，依次记录不同浓度的mecA基因对应的两组特征响应电流值，计算亚甲基蓝的响应电流值与二茂铁的响应电流值的比值并绘制成标准曲线，通过拟合曲线得到相应的线性回归方程；

7)向所述步骤1)-4)制备得到的金电极分别滴加50μL含有200pM的mecA基因、5mL MB修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的聚合酶缓冲液，以及3种含有200pM的错配基因、5mL MB修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的50μL聚合酶缓冲液和50μL含有不添加基因的5mL MB修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的聚合酶缓冲液作为空白对照组，上述五组混合溶液均在37℃混合孵育2h；采用与所述步骤5)同样的工作电极、参比电极和对电极以及试差脉冲伏安法的Tris-HCl溶液和检测电压范围，进行检测，得到二茂铁和亚甲基蓝的特征响应电流值。

2.根据权利要求1所述的一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法，其特征在于，所述步骤1)中的所述活化溶液为按照体积比为3:1配置的浓硫酸和过氧化氢混合溶液，所述活化溶液配置所采用的浓硫酸的质量分数为98％，采用的过氧化氢的质量分数为30％。

3.根据权利要求1所述的一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法，其特征在于，所述步骤2)中采用的循环伏安法扫描电压为-0.4V～0.3V。

4.根据权利要求1所述的一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法，其特征在于，所述步骤4)和所述步骤6)采用的Tris-HCl缓冲液的pH为7.4。

5.根据权利要求1所述的一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法，其特征在于，所述步骤4)和所述步骤6)采用的Tris-HCl缓冲液中含有140mM氯化钠和5mM氯化镁。