[发明专利]能有效编辑猪PCBP1基因的sgRNA及其应用

说明书

本发明提供一条能有效敲除猪PCBP1基因的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA特异性靶向猪PCBP1基因的第485位到504位的序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。本发明利用CRISPR/Cas9技术，成功地在PK15细胞系中敲除了PCBP1基因，结果显示该敲除细胞系能够在一定程度上抑制CSFV在细胞中的增殖，为制备PCBP1敲除的具有先天的抗CSFV能力的基因编辑猪提供了可能，对于抗猪瘟病毒药物靶点筛选研究及抗病毒猪的遗传育种具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一条能有效编辑猪PCBP1基因的sgRNA及应用该sgRNA获得的PCBP1敲除的细胞系。

背景技术

聚(rC)结合蛋白1是属于PCBPs家族的相对分子量大小为38kDa的RNA或者DNA结合蛋白。PCBPs家族的成员包括PCBP1-4,hnRNP K五个成员，PCBP1是无内含子基因，有报道称，PCBP1蛋白能够通过降解衔接蛋白MAVS来抑制RLR介导的信号通路。同时该蛋白还会以病毒感染依赖的方式促进cGAS结合胞质中的DNA，最近文献表明，PCBP1蛋白能够通过与经典猪瘟病毒(CSFV)的N^pro互作，促进CSFV的复制。因此该基因位点可以作为抗CSFV的潜在药物靶点以及对于抗CSFV转基因猪的制备有着重要意义。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。后来，研究人员发现，它更是一种精确且万能基因编辑工具，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，包括人、老鼠、猪、牛、羊、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物等的基因。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，该技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，在基因编辑领域有着广阔的应用前景。本发明基于前期建立的CRISPR/Cas9定点编辑平台，以猪胎儿成纤维细胞和PK-15细胞为研究对象，探究猪PCBP1基因对猪瘟病毒感染的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一条能有效敲除猪PCBP1基因的sgRNA序列，基于该sgRNA，采用CRISPR/Cas9系统可制备猪PCBP1基因敲除细胞和猪模型。

为实现上述目的，本发明首先提供了特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA，其靶向猪PCBP1基因的第485位到504位的序列。

本发明通过大量筛选发现采用上述序列作为靶标序列，具有较高的打靶效率和敲除效率。

针对上述猪PCBP1基因上的靶标序列，本发明设计了特异性的sgRNA，并进一步发现了采用SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列对应的sgRNA能够实现较高的打靶效率和PCBP1基因敲除效率。

作为本发明更优的技术方案，所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明还提供一种含有所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体。

作为本发明更优的技术方案，所述CRISPR/Cas9基因敲除载体为连接有所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA的载体。

本发明还提供所述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其为：将所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA与载体连接，得到所述CRISPR/Cas9基因敲除载体。