[发明专利]表达CAR和shRNA的逆转录病毒载体及其应用

说明书

本发明提供一种表达CAR和shRNA的逆转录病毒载体，该病毒载体中靶向LSD1的shRNA与CAR共表达。本发明中将LSD1shRNA与anti‑CD19CAR共表达于CAR‑T细胞，实现LSD1shRNA对CAR‑T细胞功能的同步调节，构建联合治疗方法。并对LSD1shRNA anti‑CD19CAR‑T细胞进行体内、外功能验证，证明LSD1shRNA anti‑CD19CAR‑T细胞在体内、外均具有较好的细胞活性、增殖能力与抗肿瘤能力。

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，特别涉及一种表达的嵌合抗原受体(CAR)和shRNA逆转录病毒载体及其应用。

背景技术

短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)属于RNA干扰(RNA interference，RNAi)范畴，转导或转染细胞后，在细胞核中合成前体shRNA，其正义链和反义链通过碱基配对形成茎区，中间未配对的核苷酸形成环状，整个结构成发夹结构。经过核糖核酸酶IIIDrosha及DGCR8加工后，被Exportin-5蛋白转运到细胞质中，然后经核糖核酸酶IIIDicer及TRBP/PACT酶切，去除环状结构的序列，形成siRNA。siRNA与RISC识别并整合后，发生解旋并去掉双链中一条RNA链，然后通过碱基互补序列识别和占据靶mRNA，导致其降解。shRNA可以通过转导的方式稳定表达，特异性靶向抑制目标mRNA的表达，在治疗、诊断及科学研究中具有广泛的应用。目前已有通过慢病毒载体转导的方式，将特异性靶向免疫检查点受体的shRNA与CAR-T细胞共表达来抑制免疫检查点受体的表达，抑制肿瘤微环境，从而调节免疫反应。

LSD1是一种依赖于黄素的单胺氧化酶，也是第一个被发现的组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶，在黄嘌呤-腺嘌呤二核苷酸存在的条件下参与单甲基化或二甲基化的H3K4或H3K9的去甲基化，从表观遗传修饰方面调控不同环境下基因转录的激活或抑制，参与不同的生理过程，包括造血、脂肪的生成、发育过程等，在肿瘤的发生中也起重要作用，LSD1抑制剂是一种潜在的抗肿瘤免疫抑制剂。抑制LSD1可刺激提高肿瘤的免疫原性，刺激干扰素依赖的抗肿瘤免疫力，促进T细胞浸润。目前已经有许多LSD1抑制剂正在进行癌症治疗的临床评估。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供构建一种新的shRNA与CAR共表达于CAR-T细胞的联合治疗方法。

在一种实施方式中，提供一种表达CAR和shRNA的逆转录病毒载体，该病毒载体中靶向LSD1的shRNA与CAR共表达。

在一种实施方式中，该病毒载体中U6启动子和EF1α启动子分别整合到CAR表达载体中，代替长末端重复序列来驱动表达，由U6启动子驱动LSD1 shRNA的表达EF1α启动子驱动抗CAR的表达，所述抗CAR优选是抗CD19 CAR和/或CD38 CAR。

在一种实施方式中，所述逆转录病毒载体中包括依次串联的U6启动子、LSD1shRNA、EF1α启动子、上游的信号肽和用于检测的myc标签；CD19 CAR抗原结合区域；CD8铰链-跨膜结构域；CD28或4-1BB协同激活结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。

在一种实施方式中，靶向LSD1的shRNA的克隆ID是TRCN0000046068，克隆名称是NM_015013.1-1812s1c1，序列是SEQ ID NO:2:GCCTAGACATTAAACTGAATA。

在一种实施方式中，靶向LSD1的shRNA的克隆ID是TRCN0000046069，克隆名称是NM_015013.1-2168s1c1，序列是SEQ ID NO:3:GCTCCAATACTGTTGGCACTA。

在一种实施方式中，提供一种靶向嵌合抗原受体T细胞，其包括由上述逆转录病毒载体表达的靶向嵌合抗原受体。

在一种实施方式中，提供一种治疗肿瘤的药物，其含有上述的嵌合抗原受体T细胞。