[发明专利]结核杆菌蛋白质内含子剪接抑制剂筛选系统、构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种结核杆菌蛋白质内含子剪接抑制剂筛选系统，以耻垢分枝杆菌为模式菌，将受蛋白质内含子调控的蛋白质的基因序列插入卡那抗性蛋白基因的65S处，以具有第一抗生素抗性的载体构建重组质粒，转入耻垢分枝杆菌后于含有第一抗生素和卡那霉素的培养基中培养，得到结核杆菌蛋白质内含子剪接抑制剂筛选系统，其中，第一抗生素为非卡那霉素的任一抗生素。通过抑制intein的剪接活性影响卡那抗性蛋白活性，从而影响重组耻垢分枝杆菌在含有卡那霉素的培养基中的生长，筛选出对intein具有抑制作用的药物，实现简单、高效、快速地筛选抗结核新药。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结核杆菌蛋白质内含子剪接抑制剂筛选系统、构建方法及其应用。

背景技术

近年来，结核病与艾滋病的共感染以及多重耐药结核病的问题日益严重，使结核病的临床治疗面临巨大挑战，开发新型抗结核药物成为防治结核病的当务之急。结核杆菌(MTB)体内三种重要的酶RecA、DnaB和SufB分别受到蛋白内含子(intein)的调控，必须完成翻译后的蛋白质剪接才能发挥功能，它们对MTB的生长繁殖有重要作用。根据所插入宿主基因的不同，MTB中所含有的3个蛋白质内含子分别称为Mtu RecA、Mtu DnaB和Mtu SufB。由于蛋白内含子剪接活性中心的氨基酸具有高度保守性，因此能够抑制其中任何一个intein的活性也可能会作用于其余intein。因此，针对intein的蛋白剪接抑制剂可以成为抗结核药物新的作用靶点，并能最小化耐药突变株的发生。蛋白质内含子(intein)是存在于前体蛋白质中的一段插入序列，在蛋白质翻译后加工成熟过程中，蛋白质内含子从前体蛋白质中自我剪切，并将两侧的蛋白质外显子以天然肽键连接形成成熟的有功能的蛋白，这一过程称为蛋白质剪接。蛋白剪接只发生于细菌、古细菌和单细胞真核细胞中，不发生于高等的真核生物，因此特异性靶向intein的抑制剂对人类具有生物安全性。由于MTB具有高度的传染性(BSL-3)和较长的生长周期(100天)，使得直接应用MTB来筛选针对intein的抗结核新药的研究受到了极大的限制。已经报道的蛋白内含子抑制剂的筛选系统包括依赖于荧光蛋白的体外筛选系统和依赖于细菌胸苷酸合酶、细菌CcdB毒素以及细菌DNA解旋酶亚单位A的体内筛选系统，但体外筛选系统需要将蛋白纯化出来进行体外筛选，操作复杂、耗时费力；而其他的筛选系统均以大肠杆菌为宿主，筛选结果差异性较大，同时已报道的筛选系统intein都具有较低的剪接活性，导致筛选灵敏度较低。因此，建立一个简单可靠的蛋白质内含子抑制剂的筛选系统势在必行。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种结核杆菌蛋白质内含子剪接抑制剂筛选系统，通过抑制intein的剪接活性影响卡那抗性蛋白活性，从而影响耻垢分枝杆菌在含有卡那霉素的培养基中的生长。通过观察耻垢分枝杆菌的生长情况，筛选出对intein具有抑制作用的药物，实现简单、高效、快速地筛选剪接抑制剂或抗结核新药。

本发明的一种结核杆菌蛋白质内含子剪接抑制剂筛选系统，以耻垢分枝杆菌为模式菌，将受蛋白质内含子调控的蛋白质的基因序列插入卡那抗性蛋白基因的65S处，以具有第一抗生素抗性的载体构建重组质粒，转入耻垢分枝杆菌后于含有第一抗生素和卡那霉素的培养基中培养，得到结核杆菌蛋白质内含子剪接抑制剂筛选系统，其中，受蛋白质内含子调控的蛋白质选自结核杆菌RecA intein、DnaB intein或SufB intein的全长或微型片段，第一抗生素为非卡那霉素的任一抗生素。

本发明申请中，微型片段(mini型)指将全长型intein的归巢核酸内切酶活性去除仅保留其剪接活性区域。

本发明采用的耻垢分枝杆菌(Msm)与结核杆菌基因具有高度的相似性，且具有生长速度快(3-5天)、传染性低(BSL-l)、菌体基因组中不含有intein序列的特点，因此以耻垢分枝杆菌为模式生物，外源导入依赖卡那霉素抗性的蛋白内含子剪接抑制剂筛选系统，模拟结核杆菌建立一个快速筛选剪接抑制剂或抗结核药物的体内筛选体系。向筛选系统的培养基中加入intein抑制剂，由于intein的剪接活性被抑制，导致卡那抗性蛋白的活性无法恢复，因此耻垢分枝杆菌将不能在含有卡那霉素的培养基中生长。