[发明专利]一种线性探针及利用其检测miRNA的方法

说明书

本发明的线性探针至少包括a、b和c三个区域：所述b区域的3’端和a区域的5’端相连，所述c区域的3’端和b区域的5’端相连；所述a区域的核苷酸序列和靶标核酸3’端互补配对，b区域的核苷酸序列通过减少空间位阻协助成环，c区域的核苷酸序列和靶标核酸5’端相同。本发明的线性探针在与靶标miRNA在逆转录过程经过两次特异识别后，在b区域的协助下形成茎环结构的cDNA，同时靶标miRNA得到释放，参与下一轮cDNA形成。通过b区域协助成环和循环逆转录，所需逆转录时间更短，同时低浓度靶标得到有效逆转录；然后以cDNA为模板进行PCR扩增实现靶标核酸快速、灵敏、特异检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，尤其涉及一种线性探针及利用其检测miRNA的方法。

背景技术

核酸检测已经广泛应用于临床检测、环境监测、传染病预防与控制等方面。其中，miRNA(miR)是一类由20-25个核苷酸组成的单链非编码RNA，它通过与靶信使RNA的3’端非翻译区结合，降解靶信使RNA或者抑制其翻译，在转录或转录后水平调控编码蛋白基因的表达，从而调控细胞分化、生长、增殖、代谢、凋亡等。miRNA的核酸检测具有重要意义。

传统的miRNA检测方法如northern印迹法，也是目前检测miRNA的金标准。该方法通过探针与靶目标杂交后转膜，显影检测miRNA。该方法灵敏度不高且要求RNA样本量大。研制夹板连接同位素探针技术检测miRNA，但需要应用PAGE电泳分离、放射自显影等复杂操作。随着新技术的不断引入和学科的交叉研究，新型miRNA分析方法被不断研发。如miRNA原位杂交分析，使用荧光标记探针与细胞或组织中的miRNA杂交，通过显色或荧光成像检测miRNA表达，直观展现miRNA的时空表达模式，但由于miRNA序列短，miRNA在杂交及洗脱过程中易丢失，易出现假阴性；微阵列芯片法通过固定探针，使miRNA目标分子与微阵列杂交，采用同位素、荧光、化学发光或电化学进行检测，实现高通量、多组分同时检测，但其灵敏度和特异性有待进一步加强。

PCR法是核酸检测灵敏度最高的方法之一，但是由于miRNA太短，以其直接作为模板不能有效设计PCR引物。研究人员开发线性探针RT-PCR法和茎环探针RT-PCR方法，用于miRNA的检测。已有的线性探针RT-PCR法，采用一条3’末端含有与靶标miRNA的3’端互补碱基的线性探针，通过互补和聚合延伸进行逆转录，延长逆转录产物cDNA的长度，使PCR引物设计成为可能，从而实现PCR扩增，但是该方法由于仅识别靶标的3’端，对于5’端突变不能有效识别，检测特异性和灵敏度有待进一步加强，或由于空间位阻不利于cDNA形成，逆转录反应时间较长；茎环探针RT-PCR法，设计一个茎环结构的检测探针，通过碱基互补配对，逆转录出靶标miRNA的5’端核苷酸序列，形成cDNA，通过PCR扩增实现miRNA的检测。该茎环探针通过增加空间构象，增强了检测的特异性，但是由于检测探针有双链结构，在用染料法检测时背景信号偏高，同样该方法也不能有效识别靶标5’端突变，存在检测特异性不足问题。最重要的一点是，无论是线性探针RT-PCR法和茎环探针RT-PCR方法，其逆转录反应需要比较长的时间(一般45分钟以上)，在核酸检测中存在明显应用限制。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种线性探针及利用其检测miRNA的方法，克服现有RT-PCR检测miRNA方法中逆转录时间长、灵敏度或特异性不足等缺点。

本说明书所用术语“解离”是指双链核苷酸变为单链核苷酸的过程。

本说明书中所用术语“自身互补配对”是指寡核苷酸自身含有互补配对的核苷酸序列，自身发生碱基互补配对。

本说明书所用术语“茎环”结构，是指一种寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该寡核苷酸分子内部的两个区域形成，其还包括至少一个“环”结构，即非互补的核苷酸分子(单链区域)。