[发明专利]FAdV-4变异株和非变异株二重荧光LAMP引物组、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了FAdV‑4变异株和非变异株二重荧光LAMP检测引物组、试剂盒及应用，所述引物组包括引物1‑1、引物1‑2、引物1‑3、引物1‑4、引物1‑5、引物1‑6、引物2‑1、引物2‑2、引物2‑3、引物2‑4、引物2‑5、引物2‑6、探针引物1‑7和探针引物2‑7。本发明针对FAdV‑4变异株和FAdV‑4非变异株各设计了特异性LAMP引物与两条特异性探针引物，使扩增反应具有很高的特异性，通过优化反应条件后，建立了的LAMP检测方法，检测结果准确可靠、操作简单，适合在基层兽医站和养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景，适合推广。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种FAdV-4变异株和非变异株二重荧光LAMP检测引物组、试剂盒及应用。

背景技术

FAdV-4属于腺病毒科禽腺病毒属，无囊膜、基因组为线性的双链DNA病毒，是心包积液-肝炎综合征(HHS)的病原。自2015年以来，心包积液-肝炎综合征(HHS)成为中国养禽业一种常见且危害极大疾病，主要发生在3～6周龄的肉鸡群中，由于HHS的高致病性和强传染性可导致发病鸡群很高的死亡率，目前发现鸭和鹅也会感染FAdV-4，宿主的广泛性使FAdV-4的防控工作难度加大。目前研究发现，与国外分离株相比，中国流行的FAdV-4发生了变异，具有新的基因型，并且FAdV-4不同毒株在致病性上也有所不同，中国流行株的致病力更强。遗传进化分析显示，中国分离株与印度分离株亲缘关系较近，表明中国毒株可能由印度分离的毒株演化而来，这更要求我们要加强进出口的防疫检疫工作。

目前已有通过分子生物学技术、血清学技术和其他常规的实验室技术，开发了FAdV-4不同的检测方法，包括病毒的分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、琼脂扩散试验(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。分离鉴定是诊断感染性疾病的金标准方法，但需要专业的实验室人员操作，并且存在较高的生物危害；PCR和qPCR方法仪器设备昂贵，不适合一些小型养殖场的检测；AGP和ELISA需要制备抗原、操作繁琐，因此上述检测方法在临床诊断中具有一定的局限性。因此，目前需要迫切需要建立一种可用于FAdV-4变异株和FAdV-4非变异株高效、敏感、快速和简便的检测方法。

环介导等温扩增(LAMP)是一种在等温条件下扩增病毒核酸的一种经济、快速、灵敏的方法，不需要特殊的仪器，具有成本低廉和结果可视化等优点。目前，目前还未见有二重荧光LAMP检测方法应用于FAdV-4变异株和非变异株鉴别诊断的报道，如果能够开发一种用LAMP技术检测FAdV-4变异株和非变异株的方法，将非常有利于在基层推广。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种FAdV-4变异株和非变异株二重荧光LAMP检测引物组、试剂盒及应用，具体方案如下：

FAdV-4变异株和非变异株的二重荧光LAMP的检测引物组，引物组包括如SEQ IDNO.1所示序列的引物1-1、如SEQ ID NO.2所示序列的引物1-2、如SEQ ID NO.3所示序列的引物1-3、如SEQ ID NO.4所示序列的引物1-4、如SEQ ID NO.5所示序列的引物1-5、如SEQID NO.6所示序列的引物1-6、如SEQ ID NO.7所示序列的探针引物1-7、如SEQ ID NO.8所示序列的引物2-1、如SEQ ID NO.9所示序列的引物2-2、如SEQ ID NO.10所示序列的引物2-3、如SEQ ID NO.11所示序列的引物2-4、如SEQ ID NO.12所示序列的引物2-5、如SEQ IDNO.13所示序列的引物2-6和如SEQ ID NO.14所示序列的探针引物2-7；

所述探针引物1-7的5’端有FAM基团、3’端有BHQ1基团，探针引物2-7的的5’端有CY5基团、3’端有BHQ2基团。

所述的LAMP的检测引物组在LAMP扩增反应体系中的应用。