[发明专利]松材线虫病巢式PCR检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种松材线虫病巢式PCR检测试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括：(1)TSINGKE金牌Mix green；(2)引物：10mmol/L TLP‑W‑S，10mmol/L TLP‑W‑A，10mmol/L TLP‑N‑S，10mmol/L TLP‑N‑A；其中引物TLP‑W‑S的序列为5＇AGACCCTCATTCTTGCC－3’，引物TLP‑W‑A的序列为5’－GGACAGTAGATGACGTAGAAT－3’，引物TLP‑N‑S的序列为5’－CGGTATCGGATGTGCTATT－3’，引物TLP‑N‑A的序列为5’－CAAGGACAGTAGATGACGTAGAAT－3’；(3)裂解液(A液)；(4)蛋白酶K(B液)；(5)ddH2O(6)阳性对照Y液。本发明能够快速、准确的对松材线虫分子鉴定和松材线虫病的早期诊断，对控制松材线虫病的检疫及病害的防治具有意义重大。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种松材线虫病巢式PCR检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

入侵的树木害虫正日益威胁着森林生态系统。理解和控制它们的传播对管理人员、研究人员和决策者来说是一个重大挑战。松材线虫病，即松树萎蔫病，是一种危害性很大的外来入侵物种，主要由松墨天牛传播，是当今世界四大林木病害之一，被称为松树的“癌症”，其病原为松材线虫，在我国属于二级检疫对象，松材线虫侵入松树30-90天后，松树就会因为线虫的快速繁殖，木质部位被松材线虫啃食，导致木材髓部被阻塞，松树蒸腾作用将会逐渐失去功能，由于树根吸收的水分无法到达树冠，导致松树针叶枯萎然后枯黄如火烧，最终导致整颗松树死亡而松材线虫却能在其中存活，并随着木材的运输而扩散到其他的地区。从1982年在我国江苏南京首次发现松材线虫至今，全国已经有多个省市检测到松材线虫病，给松林带来毁灭性的灾害和严重的经济损失。

松材线虫病由松材线虫引起，松材线虫近距离由天牛(我国主要是松墨天牛)携带传播，远距离随苗木、木材及木制品等的调运传播。线虫的耐久型幼虫可从天牛造成的伤口处侵入健康松树，并进入树脂管内，以树脂管为通道向其他部位扩散。次年，患病松木寄生的松墨天牛羽化时会携带大量线虫，并通过补充营养或产卵传播到健康松树上。松材线虫病的症状大致可分为以下4个阶段：(1)外观正常，树脂量分泌减少或停止，蒸腾作用下降；(2)针叶逐渐变色，树脂分泌停止，可观察到天牛或其它甲虫为害、产卵痕迹；(3)大部分针叶变为淡褐色、萎蔫，可见甲虫蛀屑；(4)针叶全部黄褐色或红褐色，病树整株枯死，树体有多种次生害虫栖居。松材线虫病一般在病原线虫侵染松树 15～30d后出现针叶萎蔫变色症状，外部症状出现30～45d后即可死亡

当前防止松材线虫病扩散蔓延的最有效措施是及时诊断由松材线虫病引起的松树枯死，并对可能携带松材线虫的松类植物及其产品进行准确的检疫检验。目前各地方单位对于松材线虫检测，大多都是以形态检测为主，但是松材线虫与其近缘种之间的形态学特征存在重叠及变异现象，容易造成误判、漏判。因此，松材线虫的分子生物学快速检测技术已成为控制该病害扩散的重要手段之一。因此，探求有效、快速的松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的检测技术对松树松材线虫病的防治具有重要的林业生产实践意义。