[发明专利]一类5-11双环二倍半萜骨架化合物及其制备

权利要求书

1.一种5-11双环二倍半萜骨架化合物Nigtetraene，其特征在于：其分子式为C₂₅H₄₀，结构式如下所示：

2.权利要求1所述的5-11双环二倍半萜骨架化合物的合成酶NnNS，其特征在于，该合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其N端和C端分别负责萜类环化和异戊烯基转移功能。

3.根据权利要求2所述的合成酶，其特征在于，所述合成酶含有两个保守结构域：萜类环化酶结构域含有两个用来识别Mg²⁺和底物的特征性保守基序DDVIE和NDYFSWDKE，E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守基序DDVED和DDYLN。

4.编码权利要求2所述的合成酶的基因，其特征在于：为从CS12199菌株(Nectria.nigrescens 12199)基因组中克隆得到，其多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CS12199菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21943。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因含有7个内含子，其cDNA大小为2205bp，序列如SEQ ID NO.2所示。

6.一种5-11双环二倍半萜骨架化合物重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体为运载有权利要求2或3所述的合成酶，或运载有权利要求3或4所述基因的真核或原核表达载体。

7.一种5-11双环二倍半萜骨架化合物重组表达宿主细胞，其特征在于：含有权利要求6所述的重组表达载体。

8.权利要求2或3所述的合成酶或权利要求4或5所述的基因在合成5-11双环二倍半萜骨架化合物中的应用。

9.一种异源表达5-11双环二倍半萜骨架化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、NnNS基因异源表达载体的构建

通过PCR技术，以N.nigrescens 12199基因组为模板扩增得到含有NnNS的基因序列，扩增所用到的引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

将扩增得到的片段通过同源重组与pUARA2载体连接，构建pUARA2-NnNS表达质粒，并将该连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，筛选阳性转化子，培养后提取质粒PCR验证，获取pUARA2-NnNS质粒，

B、原生质体转化

培养米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1并收集原生质体，与pUARA2-NnNS质粒混匀，培养后将长出的转化子进行PCR验证，阳性转化子即为NnNS异源表达菌株AO-NnNS，

C、异源表达菌株AO-NnNS培养及产物分离

接种异源表达菌株AO-NnNS经pUARA2质粒筛选液体培养基筛选后，进行发酵培养，对得到的发酵粗提物首先采用正向硅胶柱层析方法进行分离纯化，TLC快速检测各流份，合并斑点相同流份，减压浓缩旋蒸至干并转至已称重样品瓶中，称量样品并记录重量。