[发明专利]一种木本植物苹果果实细胞液泡蛋白的提取方法

说明书

本发明公开了一种木本植物苹果果实细胞液泡蛋白的提取方法，包括以下步骤：(1)以苹果果实为实验试材，从苹果果实细胞中提取出原生质体；(2)对步骤(1)中得到的原生质体进行分离得到液泡；(3)对步骤(2)中得到的液泡进行超低温冻融处理，得到苹果果实细胞液泡蛋白；(4)对步骤(3)中得到的液泡蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终确定获得苹果果实细胞液泡蛋白。本发明通过反复研究和试验在苹果果肉细胞中提取出液泡蛋白，提取方法效率高。

技术领域

本发明涉及木本植物细胞液泡技术领域，具体涉及一种木本植物苹果果实细胞液泡蛋白的提取方法。

背景技术

液泡是由单层膜与其内部的细胞液组成的细胞器，细胞质与液泡相隔处的一层薄膜称为液泡膜，它的组成和特性与细胞质膜相同，液泡中的液体称为细胞液。植物液泡是一种多功能的细胞器，具有参与渗透调节、储存有机代谢物、调节PH等多种生理功能，参与了植物细胞水分生理、营养生理、光合生理、生长生理、生殖生理及环境生理等多种生理过程。毫无疑问，液泡在植物细胞中是至关重要的存在，所以对液泡的研究是十分必要的。而关于液泡蛋白的研究一直是人们研究植物液泡功能的一个热点，但液泡在结构和生理上的复杂性使得人们对液泡的相关研究极具挑战性。

现已知，在草本植物中，已经可以从番茄幼苗的根尖、红甜菜根贮藏组织、盐生烟草叶片、拟南芥细胞悬浮液、以及拟南芥莲座叶中成功分离出大量高纯度的液泡，其中拟南芥在该方面的研究较为成熟，并通过蛋白质组学分析鉴定出多种液泡膜蛋白，这些蛋白中包括具有良好特性的液泡膜蛋白，如V型H⁺-ATPases和V型H⁺-PPases，以及其他与液泡膜相关但功能未知的蛋白质；在木本植物中，关于提取液泡蛋白的研究极少，有的甚至还停留在提取原生质体的阶段，现已知可以从亚灌木植物长春花的叶片中成功分离出大量高纯度的液泡，但依然未涉及提取液泡蛋白方面的研究。而苹果作为一种多年生的落叶乔木，其细胞仅细胞壁的木质化程度就远大于以上所说的木本植物和亚灌木植物，而木质化程度越高细胞壁就越厚越坚硬，在提取原生质体阶段就存在极大的困难，无论是各类酶使用的剂量还是酶解时间都需要进行探究，在保证能提取出大量完整原生质体之后才能够进一步探究提取液泡和液泡蛋白。因此，对苹果相关组织进行液泡蛋白的提取无疑是一项巨大的创新和挑战，无论是最先对原生质体的提取，还是进而对液泡的提取，还是最后对液泡蛋白的提取，这每一步都需要进行反复的研究和试验。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种木本植物苹果果实细胞液泡蛋白的提取方法，采用本发明的方法可以高效地获得苹果果实中的液泡蛋白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种木本植物苹果果实细胞液泡蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)选择状态良好的苹果果实为实验试材，从苹果果肉细胞中提取出原生质体；

(2)对步骤(1)中得到的原生质体进行分离得到液泡；

(3)对步骤(2)中得到的液泡进行超低温冻融处理，得到苹果果实细胞液泡蛋白；

(4)对步骤(3)中得到的液泡蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终确定获得苹果果实细胞液泡蛋白。

优选的，步骤(1)中，所述提取原生质体的方法为：将状态良好的苹果果肉加入灭菌的培养皿中并碾碎，再加入处理后的细胞壁酶解液，混匀，避光处理，放在露天摇床上，室温下酶解2-3小时；酶解完毕后加入W5缓冲液混匀，再用尼龙网纱进行过滤，将过滤好的材料在室温下静置或离心，得到沉淀即为原生质体。