[发明专利]一种木本植物苹果果实细胞液泡蛋白的提取方法

权利要求书

1.一种木本植物苹果果实细胞液泡蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以苹果果实为实验试材，从苹果果肉细胞中提取出原生质体；

(2)对步骤(1)中得到的原生质体进行分离得到液泡；

(3)对步骤(2)中得到的液泡进行超低温冻融处理，得到苹果果实细胞液泡蛋白；

(4)对步骤(3)中得到的液泡蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终确定获得苹果果实细胞液泡蛋白。

2.根据权利要求1所述的原生质体提取方法，其特征在于，步骤(1)中，将苹果果肉加入灭菌的培养皿中并碾碎，再加入处理后的细胞壁酶解液，混匀，避光处理，放在露天摇床上，室温下酶解2-3小时；酶解完毕后加入W5缓冲液混匀，再用尼龙网纱进行过滤，将过滤好的材料在室温下静置或离心，得到沉淀即为原生质体。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述细胞壁酶解液是将4ml甘露醇(1M)、200μl KCl(1M)、402μl MES(0.5M)、0.2g蔗糖、0.15g纤维素酶R-10、0.04g离析酶R-10、0.005g果胶酶Y-23用ddH₂O定容至10ml得到的；所述处理为：将配置好的细胞壁酶解液在55℃下加热10分钟，再将细胞壁酶解液在0℃下冷却5分钟，然后加入100μlCaCl₂(1M)。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述W5缓冲液是将6.16ml NaCl(5M)、25ml CaCl₂(1M)、1ml KCl(1M)、0.8ml MES(0.5M)用ddH₂O定容至200ml得到的。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述分离的方法为：向步骤(1)得到的原生质体中加入裂解缓冲液，混匀，然后在室温条件下静置；再加入4％聚蔗糖溶液，后加入液泡缓冲液，然后进行离心；离心后将各个离心层分离并分装，得到液泡；所述4％聚蔗糖溶液由液泡缓冲液和裂解缓冲液混合得到的。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述裂解缓冲液是将3ml甘露醇(1M)、5ml30％(wt)聚蔗糖、300μl EDTA(0.5M)、375μl第一磷酸钠缓冲液、75μl0.1％中性红溶液用ddH₂O定容至15ml得到；所述裂解缓冲液在37℃水浴下保存。

7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述液泡缓冲液是将4.5ml甘露醇(1M)、250μl第二磷酸钠缓冲液、40μl EDTA(0.5M)用ddH₂O定容至10ml得到；所述液泡缓冲液放置在冰上保存。

8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述超低温冻融方法为：将步骤(2)得到的液泡在-80℃下过夜冰冻，将液泡冻碎，得到液泡蛋白。

9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中，所述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的方法为：将步骤(3)中得到的液泡蛋白取出后放置在冰上融化，待其完全融化后，加入上样缓冲液，充分混匀以后，在沸水中煮制，煮制完成后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，跑胶跑到浓缩胶和分离胶分界面之前调节电压为110V，到达该分界面时调节电压为130V。