[发明专利]神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法

权利要求书

1.一种神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，采集浮萍；

步骤2，对步骤1采集的浮萍置于浮萍液体培养基内进行继代培养；

步骤3，夹取步骤2得到的浮萍植株，放置在诱导培养基上进行诱导培养，以获得浮萍愈伤组织；

步骤4，构建携带谷氨酸探针基因用于侵染的农杆菌-iGluSnFR农杆菌；

步骤5，活化iGluSnFR农杆菌；

步骤6，裂解iGluSnFR农杆菌使得质粒被释放出来，与愈伤组织结合：利用共生培养液溶解iGluSnFR农杆菌，得到共培养菌液，将步骤3得到的浮萍愈伤组织移至所述共培养菌液中，常温抽真空；

步骤7，避光缓慢振荡缓慢共培养，使质粒与愈伤组织充分结合；

步骤8，将共培养菌液吸出，将愈伤组织置于滤纸上待共培养菌液彻底被吸干后，将愈伤组织转移至固体共培养基上避光培养，提供愈伤组织恢复环境；

步骤9，用含头孢霉素的无菌水清洗步骤8得到的愈伤组织3-5次以洗去黏附在愈伤组织上未被完全裂解的农杆菌，将其放在滤纸上使愈伤组织中的水吸干，并烘干，移至筛选培养基上培养5-6天；

步骤10，将愈伤组织移至再生培养基上培养20-30天，使愈伤组织再生成浮萍，即可得到神经递质谷氨酸探针浮萍。

2.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，浮萍液体培养基包括0.4-0.5mM的MgSO₄·7H₂O、1.4-1.6mM的Ca(NO₃)₂·4H₂O、1.0-1.2mM的KNO₃、0.4-0.5mM的KH₂PO₄、0.4-0.5mM的Mg(NO₃)₂·6H₂O、45-55μM的CaCl2·2H2O、45-55μM的KCl、6.1-6.3μM的Na2MoO4·2H2O、69-71μM的H2BO3、28-32μM的K2H2EDTA·2H2O、56.7-58.7μM的FeNH4-EDTA、13.8-14.8μM的MnCl2·4H2O、2.8-3.8μM的ZnNa2EDTA·4H2O、4.8-5.8μM的CoSO4·7H2O、18.6-19.6μM的Na2-EDTA·2H2O，调节pH为5.6-5.8后，高压灭菌，优选的高压灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟；所述步骤2中的继代培养温度为23-24℃，光周期为16-18小时/天，光强为90-100μmolm-2s-1，每周继代一次。

3.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，诱导培养基中包括3.164g/L的B5粉，15mg/L的麦草畏，1mg/ml的2.4-D，2mg/L的6-BA，15g/L的蔗糖，6.3g/L的琼脂，调至pH为6.2–6.4后高压灭菌，优选的，灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟，所述诱导培养的温度为23℃，光周期为16小时/天，光强为95μmolm-2s-1，每两周继代一次。

4.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，构建iGluSnFR农杆菌的方法为：构建pCAMBIA-1301-35SN-iGluSnFR表达载体并转化至大肠杆菌中扩增12-16h，提取表达载体并转化至农杆菌中。

5.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤5中，iGluSnFR农杆菌的活化的方法为：从甘油冻存管中平板活化农杆菌2-3次，用接种环挑取步骤4得到的单菌落在LB培养液中小体积活化农杆菌24-30h，其次吸取小体积活化的菌液加入LB培养液中大体积活化农杆菌3-4h，最后常温离心后弃去上清，优选的，所述大体积活化用LB培养液的体积是小体积活化用LB培养液体积的3-4倍，所述LB培养液中包括45-55mg/mL的链霉素Str，20-30mg/mL的利福平，45-55mg/mL的卡那霉素。