[发明专利]使用透射带电粒子显微镜对样本进行成像的方法

说明书

本公开涉及一种使用透射带电粒子显微镜对样本进行成像的方法，所述方法包括提供样本，和提供带电粒子束以及将所述带电粒子束引导到所述样本上，用于生成一定通量的透射穿过所述样本的带电粒子。所述方法包括以下步骤：生成并记录透射穿过所述样本的带电粒子的第一能量过滤通量，其中所述带电粒子的第一能量过滤通量基本上由未散射和弹性散射的带电粒子组成。如本文所公开的方法包括另外的步骤：生成并记录透射穿过所述样本的带电粒子的第二能量过滤通量，其中所述带电粒子的第二能量过滤通量基本上由非弹性散射的带电粒子组成。然后，使用所述第一和第二记录的能量过滤通量，用于以增加的对比度对所述样本进行成像。

说明书

本发明涉及使用透射带电粒子显微镜对样本进行成像的方法，所述方法包括提供样本和提供带电粒子束，以及将所述带电粒子束引导到所述样本上，用于生成一定通量的透射穿过样本的带电粒子。

带电粒子显微法，特别是呈电子显微法的形式是众所周知且日益重要的微观物体成像技术。从历史上看，电子显微镜的基本种类已演变成数个众所周知的设备类型，例如透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和扫描透射电子显微镜（STEM），且还演变成各种子类型，例如所谓的“双束”设备（例如，FIB-SEM），其另外采用聚焦离子束（FIB），从而允许支持例如离子束铣削或离子束诱导沉积（IBID）的活动。技术人员将熟悉不同类型的带电粒子显微法。

在TEM中，用于照射样本的电子束被选择为具有足够高的能量以穿透样本（为此目的，样本通常将比在SEM样本的情况中更薄）；然后，可使用从样本中发出的透射电子的通量来创建图像。当这类TEM以扫描模式操作（因此变成STEM）时，所讨论的图像将在电子束和样本的相对扫描运动期间累积。

透射电子显微法（TEM）中存在几种用例，其中电子束在样本上方移动或扫描。

一个实例是单粒子分析（SPA）。在此工作流程中，样本含有带有许多圆形孔的网格，每个圆形孔都含有一块冰箔，上面有要成像的生物颗粒的拷贝。每个冰箔的直径约为2μm，并且这些箔的间距约为5 μm。载物台移动到孔的中心，使用2到6个不同的大约0.5 μm的束-图像偏移来获取2到6张图像，每张图像覆盖大约0.5x0.5 μm²的面积。在这种情况下，束-图像偏移意指样本上方的照射束和样本下方的图像束的组合偏转，使得在两次偏转之后，束在样本下游的成像系统中在同轴上，并且使得不在同轴上一部分样本成像。然后，工作台移动到下一个孔（通常相距5 μm），并重复该程序。该过程可以重复数百次甚至数千次，从而生成多个图像。

在单粒子分析（SPA）中，从该多个图像重构如蛋白质或病毒的生物颗粒的3D结构，其中每个单个图像可含有该相同生物颗粒的数十个拷贝。该过程中的步骤之一涉及识别并定位多个图像中的颗粒。这些颗粒的对比度（非常）低，因为该颗粒和它们嵌入其中的冰都由轻元素（N、C、O、H）组成。这使得难以识别和鉴定图像中的颗粒。

增强对比度的传统方法是散焦（CTF理论教导这会增加低空间频率的传递）或应用相位板。第一种方法的缺点是，它减少了高分辨率下的信息。后者的缺点是，实际上，所有可用的相位板都会在一定程度上阻挡束强度的一部分。

因此，本发明的目的是提供用于增加在透射带电粒子显微镜中获得的图像的对比度的方法。

为此目的，本发明提供根据权利要求1所定义的使用透射带电粒子显微镜对样本进行成像的方法。

如本文所定义的方法的特征在于，其包括以下步骤：生成并记录第一能量过滤通量的透射穿过样本的带电粒子，其中所述带电粒子的第一能量过滤通量基本上由未散射和弹性散射的带电粒子组成。带电粒子的第一能量过滤通量增强了样本中不同区域的对比度，例如颗粒和与它们嵌入其中的冰之间的对比度。