[发明专利]突变型醇脱氢酶、重组载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种突变型醇脱氢酶、重组载体及其制备方法和应用，所述突变型醇脱氢酶是在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列上进行突变，突变位点选自T105N、G137S、A165E、S180D中的一种或一种以上的组合。本发明的突变型醇脱氢酶包括单点突变体和组合突变体，与野生型醇脱氢酶相比，本发明的单点突变体和组合突变体的酶活力均得到了提高；尤其是组合突变体，其活性提高了6倍，表现出单点突变体叠加效果；本发明的突变型醇脱氢酶具有优良的催化活性，能够用于催化醛/酮化合物还原，具有较大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种突变型醇脱氢酶、重组载体及其制备方法和应用。

背景技术

醇脱氢酶（ADH）是一类分布广泛的氧化还原酶，以NAD⁺、NADP⁺或PQQ为辅酶，在人和哺乳动物的肝脏、植物组织及微生物细胞生物转化过程中发挥重要作用。基于ADH催化生产高对映选择性的手性醇性质，作为生物催化剂，其已广泛应用于医药、化工手性中间体合成等领域，如抗癫痫药物左乙拉西坦手性前体(S)-2-氨基丁酰胺、用于治疗和预防艾滋病毒的抗逆转录病毒药物阿扎那韦中间体(2R，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇、用于抑郁症和尿失禁适应症的度洛西汀手性前体(S)-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇等化合物合成中。

目前已知的醇脱氢酶可作为生物催化剂，一步酶法还原醛/酮化合物，制备生成单一光学纯度手性中间体，可简化手性中间体合成步骤、避免化学拆分难、降低生产污染。但在工业合成领域，酶法制备手性中间体时，仍面临酶催化活性较低这一关键问题。因此，有必要对现有的醇脱氢酶进行酶定向进化改造，以提高其催化活性，从而改善现有技术中如立体选择性较低、后处理过程繁琐、生产成本高等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种突变型醇脱氢酶、重组载体及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种突变型醇脱氢酶，所述突变型醇脱氢酶为如下（a1）或（a2）：

（a1）由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的且与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有相同功能的多肽；

（a2）与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。

其中，（a1）和（a2）的酶活性得到了较大的提升。更为具体的，所述突变型醇脱氢酶是在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列上进行突变，突变位点选自T105N、G137S、A165E、S180D中的一种或一种以上的组合。

优选的是，所述突变位点为T105N、G137S、A165E、S180D、T105N-G137S、T105N-A165E、T105N-S180D、G137S-A165E、G137S-S180D、A165E-S180D、T105N-G137S-A165E、T105N-G137S-S180D、T105N-A165E-S180D、G137S-A165E-S180D或T105N-G137S-A165E-S180D。

优选的是，T105N单位点突变对应的突变型醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

G137S单位点突变对应的突变型醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

A165E单位点突变对应的突变型醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

S180D单位点突变对应的突变型醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

T105N-G137S组合位点突变对应的突变型醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；