[发明专利]一种在果树组织内获取葡萄座腔菌分生孢子器的方法

说明书

本发明涉及植保领域，具体涉及一种在果树组织内获取葡萄座腔菌分生孢子器的方法，包括以下步骤：S1、采集果树枝条，在枝条上针刺获得伤口，将葡萄座腔菌接种至伤口处；S2、接种后的枝条置于接种盘中，表面喷无菌水，并覆盖有孔的保鲜膜，于培养箱中培养至葡萄座腔菌长出新的气生菌丝；S3、将枝条转移至装有无菌水的容器中，继续在培养箱中培养，直至观察到枝条病斑部位着生黑色粒点；S4、切取着生黑色粒点处枝条的韧皮组织，FAA固定液固定24h以上，做石蜡切片，使用苯胺蓝染色，即可观察到分生孢子器与分生孢子。通过本发明的方法，可以在可控条件下稳定获得葡萄座腔菌在植物组织中产生的分生孢子器。

技术领域

本发明涉及植物保护领域，具体涉及一种在果树组织内获取葡萄座腔菌分生孢子器的方法。

背景技术

葡萄座腔菌是一种可引起多种果树的枝干、果实病害的真菌，如桃树、李树、杏树、梅树等核果类果树的流胶病，猕猴桃枝干枯萎病与果实软腐病，苹果、梨的轮纹病。试验研究者经常需要观察病原菌的侵染结构，但是葡萄座腔菌属于弱寄生病原菌，且具有潜伏侵染特性，给观察研究带来困难。离体培养葡萄座腔菌很难产生分生孢子器，若直接在田间观察，田间病原菌种类多而复杂，枝干病害发病相对缓慢，直接取样很难准确清晰且高效的观察到葡萄座腔菌的分生孢子器与分生孢子。研究常利用人工接种方法来研究病原菌在果树枝干上的侵染过程，但是现有接种方法很难观察到葡萄座腔菌产生的分生孢子器与分生孢子，造成只能观察到植物产生的病斑而看不到菌丝与分生孢子器结构的情况。

发明内容

本发明为解决在试验过程中无法观察到葡萄座腔菌在植物组织中产生的分生孢子器的问题，提供了一种在果树组织内获取葡萄座腔菌分生孢子器的方法，可以在可控条件下稳定获得葡萄座腔菌在植物组织中产生的分生孢子器，给病害的典型特征观察提供研究方法与微观证据。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种在果树组织内获取葡萄座腔菌分生孢子器的方法，包括以下步骤：

S1、采集果树枝条并消毒，在所述枝条上针刺获得伤口，将葡萄座腔菌接种至所述伤口处；

S2、接种后的所述枝条水平放置在接种盘中，表面喷无菌水，用保鲜膜覆盖，保鲜膜表面扎孔透气，将所述接种盘置于培养箱中培养至接种的所述葡萄座腔菌长出新的气生菌丝并伸入伤口不易脱落；

S3、将所述枝条转移至装有无菌水的容器中，继续在培养箱中培养，直至观察到所述枝条病斑部位着生黑色粒点，容器可以选择广口瓶、三角瓶或其他实验中常用容器；

S4、切取着生黑色粒点处枝条的韧皮组织，FAA固定液固定24h以上，做石蜡切片，使用苯胺蓝染色，即可观察到分生孢子器与分生孢子。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述果树为桃树、李子树、杏树、樱桃树、猕猴桃树或苹果树中的任一种。

进一步，所述枝条为当年生健康枝条，直径为5-6mm，采样时间为6-8月份。

采用上述进一步方案的有益效果是：6-8月份的当年生枝条有一定的木质化，但又未完全木质化，经试验为最适于用作接种材料。

进一步，所述步骤S1中将所述枝条的下端三分之一去除，在剩下所述枝条上用无菌针针刺4针，使得伤口呈“井”字形，相邻两针的间距为3-5mm。

采用上述进一步方案的有益效果是枝条下端木质化程度较高且颜色较深，不利于接种发病与结果观察。

进一步，所述葡萄座腔菌培养后，用打孔器打直径为5mm的菌饼，将所述菌饼覆盖在针刺伤口上，菌丝一面与所述枝条接触，按压使得菌丝与所述枝条接触紧密。

进一步，所述葡萄座腔菌的培养方法为：将所述葡萄座腔菌活化后用无菌打孔器打菌饼，并将所述菌饼转移至新鲜无菌的PDA培养基平板上，26-28℃，12h/12h光照与黑暗交替培养5-7d。