[发明专利]促使iPSC分化为外周神经干细胞的方法及培养基和系统

说明书

本发明公开了一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞的方法及培养基和系统，在诱导多能干细胞的培养过程中使用玻连蛋白处理的细胞培养器皿，在诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞的过程中使用重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用无动物源性外周神经诱导培养基‑01进行培养。对比现有方法，本专利工艺整体优化，培养基化学成分明确，在培养基的质量控制和终产品的质量控制上有明显优势，工艺整体可做到无动物源性，避免了动物源性致病因子污染风险，适用于大的表面面积的细胞培养器皿，加大了每个批次的外周神经干细胞产量，有利工业化生产。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞的方法及培养基和系统。

背景技术

外周神经系统的神经干细胞(Peripheral Nervous System Neural Progenitor，NP)在疾病治疗、药物研发、科学研究等领域有巨大应用潜力，疾病治疗和药物研发都需要大量高纯度的NP。NP的现有获得方法主要为干细胞分化法，通过体外分化手段，将胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)或诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)分化为NP。然而，现有体外分化方法大多工艺欠成熟，使用化学成分不完全明确的培养基，对培养基关键成分的浓度也未有深入研究，所得到的NP批次间质量差异较大，不利工业生产，限制了NP的应用。分化过程所使用的试剂和物料包含了牛血清白蛋白、鼠源细胞分泌物(基质胶，Matrigel)等大量的动物源性成分，带来了动物病原体污染等风险，不利于包括临床治疗在内的各类应用。因上述情况，以现有干细胞分化法制备得到的NP，和工业规模生产和实际临床应用仍有较大的距离。另一方面，ESC本身的获得需要消耗胚胎组织，也存在一定的道德争议。此外，现有技术多用于科学研究，未尝试摸索NP大量生产的方法，未能满足工业生产和治疗应用的需求。

综上，NP的获得途径有限，制备工艺欠成熟，使用化学成分不完全明确、含动物源性成分的试剂和培养基，所得到的NP批次间质量差异较大，制备成本高、产量低，局限了NP的应用，亟需一种制备过程简化、制备时间短、污染风险小、产量和纯度高、利于工业化生产的分化方法和培养基。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞的方法及培养基和系统，在诱导多能干细胞的培养过程中使用玻连蛋白处理的细胞培养器皿，在诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞的过程中使用重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用无动物源性外周神经诱导培养基-01进行培养。

本发明提供一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞的方法，包括以下步骤：

S1：诱导多能干细胞的培养；

包括原代培养和传代培养，所述原代培养和所述传代培养中所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；

S2：诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞(Peripheral Nervous SystemNeural Progenitor，NP)；

开始分化前，将诱导多能干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01进行培养，更换培养基，培养8～10天，以胰酶替代物对诱导多能干细胞分化后得到的外周神经干细胞进行处理，收集外周神经干细胞。

进一步的，所述步骤S1中所述原代培养和/或所述传代培养中诱导多能干细胞的接种密度为1.0～2.5×10⁴个/cm²，优选为1.5×10⁴个/cm²。在1.5×10⁴个/cm²的接种密度下诱导多能干细胞的相对产量最高。