[发明专利]一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法

说明书

本发明一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法，所述方法包括病样采集、核酸DNA抽提、病毒PCR扩增、病毒全基因组序列的获得与病毒种类确定。利用本发明的诊断方法，可对烟粉虱传双生病毒病进行快速、准确的诊断，进而科学有效控制烟粉虱传双生病毒病的发生，保障农产品质量安全，同时减少农民生产成本，也促进我省多种作物健康可持续发展。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法。

技术背景

烟粉虱传双生病毒是一类植物单链环状DNA病毒，是双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)成员。烟粉虱传双生病毒在我国危害重、分布广、造成经济损失巨大。上世纪二三十年代在广州就有番茄黄顶病发生，前期零星发生，为害不大，但是在五十年代后六十年代初发生普遍，减产严重，经室内传毒试验证实，该病可嫁接传播、可经粉虱传播、但不能汁液机械摩擦、也不经种子和花粉传播，当时推测病原病毒可能是以色列番茄黄顶病毒的一个株系，这是烟粉虱传双生病毒在我国有发生的最早报道。上世纪 90年代，在广西的番茄、烟草、番木瓜和南瓜等多种农作物发现烟粉虱传双生病毒病。目前，除西藏、青海、内蒙古外，其他省(自治区) 市均有该病毒危害的报道，造成的经济损失巨大。

广东是我国烟粉虱传双生病毒病的重发区。广东气候温暖，烟粉虱周年繁殖，作物周年生长，烟粉虱传双生病毒病发生十分严重。上世纪二三十年代在广州番茄上就有烟粉虱传病毒病的发生，当时零星发生，为害不大，但是在五十年代后六十年代初发生普遍，减产严重。本世纪初，我省蔬菜番茄上烟粉虱传双生病毒病发病非常严重，该病害已导致多地无法继续种植，已严重影响到我省蔬菜产业健康发展。

发明内容

鉴于现有技术的缺陷，本发明旨在于提供一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法。制定一套标准化的、规范化的烟粉虱传双生病毒病诊断方法，为科学指导我省烟粉虱传双生病毒病绿色防控提供依据，从而有效控制我省烟粉虱传双生病毒病的发生和流行。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法，所述方法包括病样采集、核酸DNA抽提、病毒PCR扩增、病毒全基因组序列的获得与病毒种类确定，其中具体包括：

采用随机取样法对每地采集表现明显症状的病样5份，进行实验室检测诊断；

采用植物总核酸DNA提取试剂盒，完成核酸DNA提取；

利用烟粉虱传双生病毒基因组A组分的通用简并引物 AV494/CoPR，对采集的疑似病样进行PCR检测，目的片段大小为 570bp，若能扩增出目的条带，确定病样中感染了烟粉虱传双生病毒；

选取病毒PCR检测为阳性代表性病样总DNA，利用滚环扩增试剂盒进行滚环扩增；进一步用限制性内切酶对所获得滚环扩增产物进行酶切、将酶切所获得目的片段进行连接、克隆、测序；

对所获病毒基因组序列，利用DNAStar软件SeqMan进行拼接，然后利用BLAST程序在国际基因数据库中进行序列相似性搜索，进一步用SDT1.2的MUSCLE进行序列同源性比较分析，依据双生病毒国际分类标准来确定病毒种类。

利用本发明的诊断方法，可对烟粉虱传双生病毒病进行快速、准确的诊断，进而科学有效控制烟粉虱传双生病毒病的发生，保障农产品质量安全，同时减少农民生产成本，也促进我省多种作物健康可持续发展。

具体实施例

以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

实施例

本发明为一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法，所述方法包括病样采集、核酸DNA抽提、病毒PCR扩增、病毒全基因组序列的获得与病毒种类确定，其中具体包括：