[发明专利]一种检测恶臭假单胞菌的引物和方法及其应用

说明书

本发明公开了一种检测恶臭假单胞菌的引物和方法及其应用。本发明通过设计恶臭假单胞菌的PCR检测引物，并在该引物的基础上，建立了一种恶臭假单胞菌的PCR检测方法。所述PCR引物的特异性好，灵敏度高，最低核酸检测量为198.0×10supgt;‑5/supgt;ng/μL，所述PCR检测方法的操作简单，结果可靠，适用于恶臭假单胞菌的鉴定，以及对水牛乳中恶臭假单胞菌的快速检测。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域。更具体地，涉及一种检测恶臭假单胞菌的引物和方法及其应用。

背景技术

水牛是分布在我国南方的一种重要经济畜牧品种，随着生产资料的不断进步，新世纪水牛已逐渐转变成“乳用为主、肉役为辅”的发展趋势，水牛乳业已成为一项新兴产业。水牛乳以奶质优良而著称，营养全面，固形物含量高，乳香浓稠，其富含锌、铁、钙等矿物质元素，易于吸收，被誉为“奶中之王”。

假单胞菌被认为是危害原料乳及其制品的主要嗜冷菌，在低温储藏过程中仍能生长繁殖，其分泌的胞外蛋白酶具有耐热性，甚至能在超高温灭菌处理后仍有活性残留，使乳制品出现腐臭、苦味，粘度增加，形成凝胶、沉淀等现象，严重影响原料乳及其制品的质量，使得灭菌乳的货架期减短。但由于假单胞菌的种类众多，菌株形态以及生化性质之间差异性小，导致假单胞菌的分型困难。特别是分子分型方法出现后，许多从原料乳中发现的假单胞菌其实并不属于荧光假单胞，导致荧光假单胞菌的危害性可能被高估。因此，建立更加可靠的分子分型方法，对准确评估假单胞菌中不同菌种的危害潜力非常重要。有学者从中国地区不同原料乳中分离鉴定出67种假单胞菌，其中荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、莓实假单胞菌和隆德假单胞菌等都是常见的菌种。

中国专利CN 103898221A公开了恶臭假单胞菌的PCR检测用引物及检测方法，其目的在于检测进口环保微生物菌剂的恶臭假单胞菌，增加进口环保微生物菌剂的质量安全，保护我国自然环境不受外来细菌的破坏，但该PCR检测引物的灵敏度不高，仅2.36×10^-2μg/mL。因此，建立一种特异性更强，灵敏度更高的恶臭假单胞菌的PCR检测方法，对保障水牛乳的质量安全具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种检测恶臭假单胞菌的引物和方法及其应用。

本发明的目的是提供一种检测恶臭假单胞菌的引物。

本发明的另一目的是提供一种检测恶臭假单胞菌的方法。

本发明的再一目的是提供一种检测恶臭假单胞菌的试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种检测恶臭假单胞菌的PCR引物，包括上游引物pp1和下游引物pp2，其序列依次如SEQ ID NO.1～2所示。

上述PCR引物是以genebank上恶臭假单胞菌的gyrB基因序列为靶基因进行设计，通过实验筛选得到。实验表明，本发明设计筛选得到的PCR引物pp1和pp2(SEQ ID NO.1～2)可特异性扩增恶臭假单胞菌上的目的片段，可用于检测或鉴定恶臭假单胞菌。

因此，本发明申请保护SEQ ID NO.1～2所示引物在检测/鉴定恶臭假单胞菌中的应用。

本发明还申请保护SEQ ID NO.1～2所示引物在制备检测/鉴定恶臭假单胞菌的产品中的应用。

优选地，SEQ ID NO.1～2所示引物可用于检测水牛乳中的恶臭假单胞菌或用于制备检测水牛乳中的恶臭假单胞菌的产品。

本发明还提供一种检测/鉴定恶臭假单胞菌的PCR方法，其包含以下步骤：

S1.提取待测样品中的细菌基因组DNA；

S2.以步骤S1所得DNA为模板，用SEQ ID NO.1～2所示PCR引物进行扩增；