[发明专利]一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法

权利要求书

1.一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)刺葡萄细胞系选择：以长期在固体培养基中或液体培养基中继代保持的、具有花青素合成能力的、紫红色的刺葡萄细胞系为培养材料；

(2)刺葡萄细胞同步化培养：在固体培养基中培养的刺葡萄细胞，挑选紫红色均匀的、生长状态一致且旺盛生长的刺葡萄细胞，于同一继代固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养3～4代，使刺葡萄细胞生长状态达到同步化，细胞松散、紫红色均匀、绝大部分呈圆形；

在液体培养基中培养的刺葡萄细胞，则直接进入步骤(5)；

(3)刺葡萄悬浮细胞系建立：将达到同步化生长的刺葡萄细胞，培养至18天，于超净工作台中，取新鲜、松散易碎的红色愈伤组织，放入液体培养基中，用镊子轻轻夹散细胞团，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养，建立刺葡萄细胞悬浮培养；

(4)旺盛刺葡萄悬浮细胞获取：刺葡萄细胞进入液体悬浮培养后，重复4～5代培养，以获得细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞，悬浮细胞小且呈圆形、细胞质浓密、细胞生长旺盛；

(5)刺葡萄悬浮细胞增殖：刺葡萄悬浮细胞每隔10天，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，进行继代增殖培养；

(6)刺葡萄细胞固体轮回培养：取适量刺葡萄液体悬浮细胞，平铺到新鲜的固体培养基上，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，进行固体轮回培养，即可获得大量刺葡萄细胞；所述平铺培养，具体为：将刺葡萄悬浮细胞培养10天，至指数生长期中期，于超净工作台内，按细胞悬浮液体积：固体培养基表面积＝1:30～35的比例，用灭菌移液器将均匀悬浮的细胞悬浮液转移到固体培养基上，并迅速轻盈的振摇培养瓶，使悬浮液细胞均匀的贴合在固体培养基表面上，也可以采用分点式将细胞悬浮液点滴在固体培养基上，然后立即振摇培养瓶，以均匀分散细胞，防止细胞成团附着在培养基上；

(7)刺葡萄细胞液体轮回培养：取适量在固体培养基中轮回培养的刺葡萄细胞，转接到新鲜的液体培养基中进行培养，即可重新形成高度分散的悬浮细胞系；

所述固体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉的培养基，pH调整至6.0；

所述液体培养基为MS基本培养基添加了1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖的培养基，pH调整至6.0。

2.根据权利要求1所述的一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：步骤(2)所述对数细胞同步增殖培养方式，即将刺葡萄愈伤组织接种后培养至18天，固体培养基中培养18天时刺葡萄愈伤组织细胞生长正处于对数生长起始阶段，细胞生长同步化高，于超净工作台中，取适量的愈伤组织接种到新鲜的固体培养基中，能使刺葡萄愈伤组织细胞在较短的时间内进入高度的生长同步化，有利于刺葡萄细胞悬浮培养的启动和悬浮细胞系的建立。

3.根据权利要求1所述的一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：步骤(5)所述继代增殖培养，具体为：将刺葡萄悬浮细胞培养至指数生长期中期即培养至10天，于超净工作台内，用力振摇三角瓶，使细胞悬浮液均匀分散，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，用灭菌过的移液器移取刺葡萄细胞悬浮液，转入装有液体培养基的三角瓶中，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养。

4.根据权利要求1所述的一种提高刺葡萄细胞增殖效率和花色苷产量的方法，其特征在于：步骤(7)所述重新形成高度分散的悬浮细胞系，具体操作为：将固体培养基轮回培养20天的刺葡萄细胞，于超净工作台中，用灭菌的药勺轻轻刮去表层0.01～0.05cm的细胞，然后刮取里层细胞，转接到液体培养基中，接种量为细胞质量：液体培养基体积＝1:10～15，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光周期12h光照/12h黑暗，摇床转速120rpm～130rpm，振荡培养，重新形成刺葡萄悬浮细胞系，以利于形成刺葡萄细胞快速增殖的良性的固液轮回培养体系。