[发明专利]高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA

说明书

本发明提供一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。本发明的Taq DNA聚合酶突变体，在加A效率上显著提高；能够耐受血液，腐殖酸，靛蓝这些常见的抑制剂；能直接进行PCR扩增，不需对DNA样本进行提取；显著缩短扩增时间，能更快获得STR检测结果。

技术领域

本发明专利涉及一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA，属于生物技术领域。

背景技术

STR（Short Tandem Repeat 短串联重复序列）是一种广泛存在于人类基因组中的分子遗传标记，是由2～6个碱基组成核心单位串联重复而形成的DNA序列。核心序列重复数目的变化，使其在群体中呈现多态性；同时在同一家系中又以孟德尔方式遗传，具有高度的遗传保守性；而且检测方法相对简单。因此该遗传标记物在法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等领域广泛应用。

Taq DNA聚合酶是第一个从水生嗜热杆菌中分离出来的耐热性DNA聚合酶。因为Taq DNA聚合酶具有极好的热稳定性，能够耐受PCR热变性过程，不需要每个循环额外添加新的聚合酶；因此该酶后面被广泛应用于各种PCR技术。它具有5'-3'聚合活性，5'-3'外切活性，无3'-5'外切活性；同时具备在PCR产物3'末端加A的特性。STR常用的检测手段是PCR扩增之后跑毛细管电泳；毛细管电泳分辨率高可以区分1bp的产物。一般的Taq DNA聚合酶在跑毛细管电泳时会呈现一个碱基差异的分裂峰，一个加A一个不加A产物；这是由于TaqDNA聚合酶对于产物加A不完全导致的；这种有时候会影响对结果的判读。为了解决此问题，一般会在扩增结束之后增加60℃/72℃的延伸时间，确保产物的完全加A；但是这种方法会增加扩增时间。

STR作为法庭医学常用的检测手段之一，其常见的样本是血液或者血卡，为了缩短检测时间，会直接进行血液样本或者血卡的直扩而不对样本进行提取；这需要PCR所用的Taq DNA聚合酶拥有耐受血液的能力。另一方面从犯罪现场收集的DNA样本很多与泥土，沙石，腐烂树叶等混合在一起，提取的时候会有相对应抑制物的残留；抑制剂会阻碍目的片段的扩增导致扩增结果出现STR等位基因的丢失或者直接导致所有基因座扩增失败。因此这也要求用于STR的Taq DNA聚合酶具备一定的耐抑制能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，不但加A效率高，对血液和抑制剂的耐受能力也强。

本发明采用的技术方案为：

一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。其中D188K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第188位的天冬氨酸突变为赖氨酸； T506R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第506位的苏氨酸突变为精氨酸；T710R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第710位的苏氨酸突变为精氨酸；A744K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第744位的丙氨酸突变为赖氨酸。

上述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶的编码DNA，其序列如SEQ ID NO：2所示。

上述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶在STR检测中的应用。

本发明的Taq DNA聚合酶突变体，在加A效率上显著提高；能够耐受血液、腐殖酸、靛蓝这些常见的抑制剂；能直接进行PCR扩增，不需对DNA样本进行提取；显著缩短扩增时间，能更快获得STR检测结果。

附图说明

图1是本发明实施例1扩增产物的毛细管电泳结果。其中左边4个为野生型Taq酶的扩增结果，ATGC分别代表扩增引物5端碱基分别为ATGC；右边为本发明突变型Taq酶B-Taq扩增5末端碱基为ATGC的引物的扩增结果。