[发明专利]一种融合蛋白TpG、其编码基因、重组质粒、菌株及应用

说明书

本发明属于蛋白的基因工程领域，具体涉及一种融合蛋白TpG、其编码基因、重组质粒、菌株及应用。本发明的融合蛋白TpG的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明的融合蛋白TpG由硫氧还蛋白标签(Trx)、低pH插入肽(pHLIP)和植物毒素Gelonin三部分组成，本发明首次设计并成功原核表达具肿瘤酸度响应的植物毒素Gelonin(TpG)，并对其进行了系统全面的表征。在弱酸性条件下，TpG可更有效地内化进入肿瘤细胞，通过诱导肿瘤细胞凋亡和抑制胞内蛋白质合成来抑制肿瘤细胞生长。体内实验表明，与Gelonin相比，TpG可显著抑制肿瘤生长。本研究可为Gelonin的生物医学应用奠定理论和实验基础。

技术领域

本发明属于蛋白的基因工程领域，具体涉及一种融合蛋白TpG、其编码基因、重组质粒、菌株及应用。

背景技术

植物毒素Gelonin是一种来源于大戟科植物Gelonium muhiflorum种子中的蛋白，其分子量约为30kDa，属于I型核糖体失活蛋白。由于其N-糖苷酶活性，Gelonin可以有效抑制蛋白质翻译，因而具有高效细胞杀伤力，是一种有效的抗肿瘤分子。然而，Gelonin缺乏与细胞膜结合的结构域、半衰期短、稳定性差，这就大大限制了其生物医学应用。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术的不足，提供一种融合蛋白TpG，所述融合蛋白TpG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述的融合蛋白TpG，由硫氧还蛋白标签、低pH插入肽和植物毒素Gelonin三部分组成。

本发明的目的之二，提供编码所述融合蛋白TpG的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的之三是提供含有所述融合蛋白TpG基因的重组质粒，其构建方法如下：

化学合成如SEQ ID NO.2第478位到第1344位所示的pHLIP-Gelonin序列，将其连接在pUC57空质粒上，得到pUC57-pHLIP-Gelonin重组质粒，将pUC57-pHLIP-Gelonin重组质粒和pET32a质粒分别用相同的内切酶进行双酶切，然后将基因pHLIP-Gelonin与质粒pET32a连接，得到重组质粒pET32a-pHLIP-Gelonin。

本发明的目的之四是提供含有所述质粒的基因工程菌，是将所述质粒转化到大肠杆菌中，得到含有融合蛋白TpG基因的基因工程菌。

本发明的目的之五是提供所述基因工程菌的表达产物在制备治疗癌症的药物中的应用，所述表达产物为融合蛋白TpG。

进一步的，所述癌症包括但是不限定于卵巢癌、肺癌和结肠癌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

植物毒素Gelonin具有高效的细胞杀伤力但自身难以进入细胞；低pH插入肽(pHLIP)在酸性条件下可通过形成跨膜a螺旋将其C端插入细胞膜内；肿瘤细胞由于其异常代谢途径而始终处于弱酸性微环境。基于以上三点，本发明设计并原核表达一种肿瘤酸度响应Gelonin功能融合蛋白(Trx-pHLIP-Gelonin，TpG)，并系统研究其体内外抗肿瘤效应。该功能融合蛋白由硫氧还蛋白标签(Trx)、低pH插入肽(pHLIP)和植物毒素Gelonin三部分组成。Trx可增强蛋白溶解性和代谢稳定性，低pH插入肽(pHLIP)具有肿瘤酸度响应特性与高效穿膜能力，植物毒素Gelonin具有卓越的抗肿瘤活性。将TpG注射进体内后(尾静脉或瘤内注射)，该功能蛋白可通过EPR效应经血液循环在肿瘤组织积累，由于其弱酸性环境，pHLIP与细胞膜相互作用，形成跨膜α螺旋，并将与其C端连接的Gelonin递送至肿瘤细胞内，核糖体发生不可逆失活，抑制其蛋白质的合成，导致细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。本发明研究结果将为恶性肿瘤的高效靶向治疗提供新策略，提高Gelonin的选择性与递送效率，增强其抗肿瘤作用，并为Gelonin的临床应用奠定理论和实验基础。

附图说明